人参皂甙-Rh2对人肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响

　　【摘要】　目的　研究人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)对肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法　采用MTT比色法观察GS-Rh2对体外培养的Bel-7404细胞生长的抑制作用;应用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化;采用免疫组化S-P法检测药物处理前后凋亡相关基因产物p53、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果　①MTT比色法测定显示,Bel-7404细胞经GS-Rh2作用后生长受抑制,呈剂量依赖性和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)为27.6μg/ml。②流式细胞仪检测证实,GS-Rh2能诱导Bel-7404细胞凋亡。③当GS-Rh2浓度由12.5μg/ml增加至50.0μg/ml时,细胞凋亡率(AR)依次升高;但GS-Rh2浓度进一步增加时,AR未见相应升高。④GS-Rh2可将细胞周期阻滞于G1期。⑤GS-Rh2处理细胞后,突变型p53表达下调而Bax表达上调,Bcl-2在GS-Rh2处理前后无明显变化。结论　①GS-Rh2能抑制体外培养的Bel-7404细胞增殖并诱导其凋亡;②GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡可能是通过上调Bax表达、下调突变型p53表达以及阻滞细胞周期而实现。

　　【关键词】　人参皂甙-Rh2;　肝肿瘤;　增殖;　凋亡

　　近年来研究发现,我国的名贵中药人参具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂甙(Ginsenoside,GS)能诱导肿瘤细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。人参皂甙单体-Rh2(Ginsenoside-Rh2,GS-Rh2)是一种原人参三醇型皂甙,是红参的主要抗癌成分。我们以人肝癌Bel-7404细胞株为受试对象,研究GS-Rh2对Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响,并采用免疫组化法检测药物处理前后凋亡相关基因产物Bcl-2、Bax和p53蛋白表达的变化,旨在进一步阐明人参抗肿瘤作用的机理,为将其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。

　　材料与方法

　　一、 实验材料与主要仪器

　　人肝癌Bel-7404细胞株:由中国科学院细胞生物研究所引入,南华大学附属第一医院临床医学研究所传代培养;人参皂甙Rh2:购自中国科学院生物制品研究所,溶于PBS(pH7.4)中配成50 mg/ml母液,超滤除菌,-20℃保存;RPMI-1640培养基:美国Gibco公司产品;小牛血清(FBS):杭州四季青生物工程公司产品;鼠抗Bcl-2单抗和兔抗Bax多抗:MBI公司产品,购于福州迈新公司;酶联免疫检测仪:第四军医大学与国营华东电子管厂联合研制,型号为DG3022;流式细胞仪:型号为Beckerman Coulter EP-ICS-XL。

　　二、 实验方法

　　1.细胞培养:Bel-7404细胞用含10%小牛血清的培养液(含100 IU/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素),于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养,细胞呈单层生长,达80%左右时传代。

　　2.药物处理:细胞传代后,接种于96孔或24孔培养板内,当细胞50%~60%融合、贴壁良好时,换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测。

　　3.GS-Rh2对细胞生长的抑制作用:取对数期细胞制成细胞悬液,浓度1×105/ml,接种于96孔培养板内,每孔100μl,6 h后加入不同浓度的GS-Rh2,使终浓度分别为6.25,12.5,25,50,100μg/ml,每一浓度组均设4孔。对照孔及调零孔加100μl培养液。各孔总体积均为200μl。分别在加药后6,12,24,48,72 h采用MTT法检测各孔中细胞的抑制率。用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测各孔的吸光度(A值),按下列公式计算抑制率(IR):IR(%)=(1-给药孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。具体步骤见参考文献。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线,由此计算出IC50值。

　　4.GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析:本实验共设立5个GS-Rh2浓度组,即A、B、C、D、E五组,浓度分别为0,12.5,25.0,50.0,100.0μg/ml,培养24 h后分别收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组的凋亡率和细胞周期变化,分析GS-Rh2诱导凋亡的量效关系。

　　5.GS-Rh2诱导凋亡的时效关系:取25.0μg/ml(IC50的近似值)GS-Rh2分别作用0,12,24,48 h后,检测凋亡率。

　　6.凋亡细胞的检测:分别收集各组细胞,每组约1×106个,4℃PBS洗2次(pH=7.2),500 r/min,8 min,离心去上清,然后加1.5 ml 70%乙醇重悬并固定细胞。经一系列处理后,上机检测,每组计数10 000个细胞,检测凋亡细胞,其中凋亡细胞所占比例即为凋亡率(AR);并分析处于不同周期的细胞比例。详细方法见参考文献[5,6]。

　　7.免疫组化:收集细胞,制备细胞涂片及石蜡包埋切片。石蜡切片和细胞涂片用0.01 mol/L PBS(pH7.2)冲洗3次×6 min;每张切片加50μl过氧化酶阻断剂,室温下孵育10 min;PBS冲洗3次×5 min;每张切片加50μl非免疫性动物血清,室温下孵育5 min;PBS冲洗1次×5 min;每张切片加50μl一抗,4℃过夜;PBS冲洗3次×5 min;每张切片加50μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液,室温孵育10 min;PBS冲洗3次×5 min;每张切片加100μl新鲜配制的DAB溶液,显色5~10 min;自来水冲洗,苏木素浅染,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。免疫组化的阳性结果判断根据文献确定的标准进行,以胞核、胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞,并设立阳性对照和阴性对照。

　　三、统计学分析

　　不同处理组间凋亡率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有显著性。

　　结　　果

　　1.GS-Rh2对Bel-7404细胞生长的抑制作用:于药物处理后48 h,采用MTT法测得各组的抑制率(IR),结果表明:Bel-7404细胞的抑制率对GS-Rh2的浓度有明显依赖关系,当GS-Rh2浓度为6.25,12.5,25.0, 50. 0, 100. 0μg/ml时, IR分别为23. 7%,37.3%,54.2%,79.7%和93.2%,采用SPSS统计软件进行曲线拟合,计算出GS-Rh2对Bel-7404细胞的半数抑制浓度(IC50)为27.6μg/ml(图1)。25μg/mlGS-Rh2处理作用于细胞不同时间,采用MTT法计算抑制率,上述实验共重复6次,结果如表1所示。

　　从表1可以看出,随着作用时间延长,IR逐渐增加,由19.5%递增至71.0%。

　　2.GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的量效关系与时效关系:采用流式细胞仪检测凋亡细胞,各处理组凋亡率见表2,3。

　　由表2可见,凋亡率随药物浓度增高而递增,但50.0μg/ml与100.0μg/ml组凋亡率差异无显著性。

　　由表3可见,在25.0μg/ml的GS-Rh2作用下,AR随作用时间延长而呈现递增的趋势。

　　3.GS-Rh2作用后细胞周期变化:药物处理24 h后收集细胞,用流式细胞仪检测各周期的细胞数(每组检测10 000个细胞)。由表4可见,不同浓度GS-Rh2可使G1期细胞明显增多。

　　4.Bcl-2、Bax、p53基因表达的免疫组化检测:免疫组化结果显示,Bax阳性表达见于胞浆,对照组细胞涂片,Bax表达弱阳性,GS-Rh2处理的细胞Bax表达较对照组增强。对照组大部分细胞p53蛋白呈强阳性,主要着色于细胞核,而GS-Rh2处理组细胞p53蛋白呈弱阳性表达。Bcl-2阳性表达可见于胞膜和胞浆,对照组和GS-Rh2处理组细胞均呈阳性表达,二者差异无显著性。

　　讨　　论

　　肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有极密切的关系。许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。凋亡与肿瘤防治的关系是近年来的研究热点之一。现代药理学研究已经证实,人参具有抗肿瘤作用。本研究证实了人参中的活性成分之一——人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)能抑制人肝癌Bel-7404细胞增殖并诱导其凋亡,从而为开发出一种抗肿瘤新药提供进一步的实验依据。

　　1.GS-Rh2能抑制Bel-7404细胞生长及诱导细胞凋亡:我们采用MTT法证实了GS-Rh2能抑制Bel-7404细胞生长,这种抑制作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。GS-Rh2对Bel-7404细胞的半数抑制浓度(IC50)为27.6μg/ml。随着GS-Rh2浓度增加和作用时间延长,Bel-7404细胞的存活率逐渐下降。应用流式细胞仪研究证实,GS-Rh2在6.25~100.0μg/ml浓度范围内具有诱导凋亡的作用。

　　2.GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的机理:Ano-drew等认为,细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关,细胞阻滞于哪一期,凋亡就发生在哪一期。

　　现代药理学研究证实,人参中含有多种具有抗肿瘤作用的皂甙,它们能诱导凋亡及引起细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤生长。韩萍等认为,人参皂甙-Rg3有抗肿瘤生长的作用,与氟尿嘧啶、长春新碱、环磷酰胺、氨甲蝶呤等抗肿瘤药物合用,有明显的协同作用。Kim等研究表明,GS-Rh2有诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡的作用。马文彬等应用流式细胞仪研究GS-Rh2对S180肉瘤细胞周期移行的影响,发现GS-Rh2能引起细胞周期阻滞于S期。本研究应用流式细胞仪检测凋亡并进行细胞周期分析,证实了GS-Rh2作用后G1期细胞增加。在一定范围内,凋亡细胞所占比例呈现出随药物浓度增加及作用时间延长而递增的趋势。但50μg/ml组与100μg/ml组凋亡率差异无显著性,说明GS-Rh2达一定浓度后,Bel-7404细胞的凋亡率不再随药物浓度的增加而进一步增加。这可能是由于细胞凋亡是一种在严格的程序性控制下发生的细胞死亡形式,外界刺激通过信号传递系统到达细胞内是启动凋亡的必要条件,随后在一定的内部程序控制下即通过细胞的中央调控使细胞出现凋亡的形态学改变,当GS-Rh2的浓度达一定值后,凋亡率不再随药物浓度增加而增加。

　　3.凋亡相关基因表达的变化:本研究在蛋白水平用免疫组化方法检测了p53、Bcl-2和Bax蛋白在药物处理前后的表达。免疫组化结果表明,Bcl-2蛋白表达在对照组及各实验组差异均无显著性;对照组Bax蛋白表达弱阳性,处理后表达增强,细胞内棕色颗粒加深;而对照组p53表达为强阳性,GS-Rh2处理后呈弱阳性表达。由于wtp53蛋白半衰期短,仅8~10 min,而mtp53蛋白半衰期可长达数小时,故应用常规的免疫组化方法检测到的p53蛋白是mtp53,因而我们认为GS-Rh2能使mtp53表达下调。

　　我们认为,GS-Rh2诱导凋亡与上调Bax蛋白表达及下调mtp53蛋白表达有关。Bax表达增强,形成Bax-Bax同源二聚体的量增加,从而诱导凋亡。wtp53可能通过多种机制诱导凋亡,总体来说,包括依赖转录和不依赖转录途径,这主要取决于细胞类型和刺激信号[11]。p53的转录靶子主要是p21WAF1/Cip1和Bax。其中,Bax是p53依赖的凋亡信号途径的重要中介物之一。此外,p53也可能通过其他机制,如诱导氧化反应相关基因的表达和降解线粒体成分等诱导凋亡。当p53基因突变后即失去诱导凋亡的作用,并且能抑制凋亡。

　　Bcl-2是否参与介导Bel-7404细胞凋亡,根据本研究结果尚无法确定。因为Bcl-2相关蛋白的翻译后修饰也是决定其凋亡调控效应的重要因素,这种翻译后修饰的主要形式是蛋白磷酸化,磷酸化的Bcl-2蛋白失去抑制凋亡的功能[12]。但本研究仅通过免疫组化的方法不能区分磷酸化和去磷酸化的Bcl-2蛋白。

　　本研究证实GS-Rh2能抑制Bel-7404细胞生长,这种作用可能部分是通过诱导凋亡而实现的,其诱导凋亡作用可能与Bax表达上调、mtp53下调以及阻滞细胞于G1期有关。