人参皂苷Rh2对白血病HL_60细胞凋亡的诱导作用

　　李罗丝1，罗志勇2，文斌2，刘水平2，张阳德1

　　(1.中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙410008;2.中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南长沙410078)

　　药用植物人参Panax ginseng C.A.Meyer根为传统名贵中药材，其主要药用有效成分—人参皂苷(ginsenoside)系异戊二烯单元(五碳)构成的四环三萜达玛烷类化合物，由人参二醇和人参三醇皂苷组成。迄今为止，确定了结构的皂苷成分有30余种，各皂苷单体均具有其独特的药理作用，临床应用十分广泛[1]。尤其值得关注的是，近年来国内外学者对人参皂苷Rh2[1~7]的抗肿瘤药理学研究日趋活跃和深入。研究表明，人参皂苷Rh2(ginsenoside Rh2,G-Rh2)对肺癌[2]、肝癌[3]、神经细胞和胶质瘤[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等多数肿瘤组织细胞，在抑制肿瘤细胞增殖，诱导分化和/或凋亡[1~7]方面均表现出明显的药理活性。本研究探讨了G-Rh2对人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的诱导作用。

　　1材料与方法

　　1.1细胞系及主要试剂

　　人急性早幼粒白血病HL-60细胞系由本室保存;20(S)人参皂苷Rh2购自吉林大学化学系，高效液相色谱鉴定纯度为98.7%;MTT【3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrasodiumbromide】、DMSO(Dimethyl sulfoxide)、蛋白酶K及RNaseA购自Sigma公司;RPMI 1640培养基购自Hyclone公司;小牛血清购自中南大学细胞生物学实验室;琼脂糖购自Takara公司。

　　1.2人参皂苷Rh2对HL-60细胞增殖的影响

　　人白血病HL-60细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，5%CO2条件下悬浮培养。取对数生长期HL-60细胞2×104/mL的单细胞悬液以每孔200μL体积接种96孔板，加入人参皂苷Rh2(0~60μmol/L，溶解参皂苷Rh2的DMSO终浓度<0.1%)处理HL-60细胞;在37℃和5%CO2及饱和湿度下，培养24、48和72 h;每孔加入MTT溶液(5 g/L 20μL，37℃继续孵育4 h，终止培养;离心(200 g，5 min)，然后弃去孔内培养液，每孔加入200μL DMSO，振荡10 min;在酶联免疫检测仪上测定570nm波长各孔吸光度;计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100%，根据细胞存活曲线计算人参皂苷Rh2抑制HL-60细胞增殖的IC50或IC75值。

　　1.3人参皂苷Rh2对HL-60细胞凋亡的影响

　　采用DNA的片段化实验检测细胞凋亡[8]。以2×105/mL接种HL-60细胞于培养瓶，分别采用0、5、10、25、34和40μmol/L的人参皂苷Rh2处理HL-60细胞6 h，采用25μmol/L(IC50)的人参皂苷Rh2分别处理HL-60细胞0、12、24和48 h;分别收集细胞，计数，并取等量的细胞PBS洗1次，1 600 g离心5min，去上清;细胞沉淀按每106个细胞加入细胞裂解液(1%NP-40，20 mmol/L EDTA，50 mmol/LTris-HCl，pH7.5)100μL的比例裂解10 s，收集上清用等量的细胞裂解液重复处理1次;上清加入终浓度1%SDS和终浓度5 g/L RNase A，56℃温浴2h;加入终浓度2.5 g/L蛋白酶K，37℃温浴过夜;加入1/2倍体积的10 mol/L醋酸铵和2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，离心，去上清，75%乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心，去上清;20μL TE(10 mmol/LTris-HCl，1 mmol/L EDTANa2，pH8.0)溶解DNA沉淀;取10μL样品于2%琼脂糖凝胶TBE缓冲液中50 V电泳2 h;溴乙锭染色，凝胶成像仪下观察DNA条带并保存。

　　2结果

　　2.1人参皂苷Rh2能明显地抑制HL-60细胞增殖

　　MTT结果显示，0～60μmol/L的G-Rh2分别处理HL-60细胞24、48和72 h后，人参皂苷Rh2能明显抑制HL-60细胞增殖，呈浓度依赖性关系;人参皂苷Rh2作用HL-60细胞48 h的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)为25μmol/L，

　　2.2人参皂苷Rh2对HL-60细胞凋亡的影响

　　DNA片段化实验显示，人参皂苷Rh2能明显诱导HL-60细胞凋亡，呈浓度和时间依赖效应，且25μmol/L G-Rh2作用HL-60细胞48 h后，可见明显的凋亡特征性的DNA梯状图谱(DNA ladder)，34μmol/L G-Rh2处理HL-60细胞6h就明显可见

　　A：G-Rh2处理HL-60细胞6 h;M:100 bp DNA ladder;1、2、3、4、5分

　　别代表0、10、25、34、40μmol/L G-Rh2处理组

　　B：25μmol/L G-Rh2作用HL-60细胞的不同时间;M：100 bp DNA

　　ladder;1、2、3、4分别代表0、12、24、48 h G-Rh2处理组

　　3讨论

　　肿瘤是一种体细胞无限制性地克隆扩增所致的疾病。肿瘤的产生和发展是一个逐渐演化的过程，并且在演化的过程中获得无休止的遗传和表观遗传改变，最终导致肿瘤的异质性和多样性。尽管如此，不同的肿瘤仍存在共同的特征-失控的细胞增殖与凋亡的受抑，亦是肿瘤形成的核心要素。因此，寻找能够抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的药物将成为肿瘤治疗干预的切入点[1]。有鉴于此，本研究探讨了人参皂苷Rh2对人白血病HL-60细胞增殖与凋亡的影响。结果表明，G-Rh2能有效抑制HL-60细胞增殖，且抑制效应呈浓度依赖性关系，见图1，半数抑制浓度IC50为25μmol/L;DNA片段化实验显示，人参皂苷Rh2能明显诱导HL-60细胞凋亡，呈浓度和时间依赖效应，且25μmol/L G-Rh2作用HL-60细胞48 h后，可见明显的凋亡特征性的DNA梯状图谱(DNA ladder)，34μmol/L G-Rh2处理HL-60细胞6h就明显可见DNA梯状图谱，见图2。此外，Kim报道G-Rh2能诱导HL-60细胞向成熟的粒细胞分化[7]。因而，G-Rh2诱导HL-60细胞凋亡与分化的关系及其分子机制仍值得进一步探讨。本研究结果表明，G-Rh2能有效的抑制HL-60细胞增殖，并诱导HL-60细胞凋亡，这为下一步深入阐明G-Rh2抗白血病分子调控机制提供了重要实验依据。