人参皂苷Rh2诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

人参皂苷Rh2诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

摘要: 目的 研究人参皂苷Rh2(G-Rh2)对肝癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用, 并探讨其作用机制。方法 用终浓度为5、10、20mg/L的G-Rh2作用于HepG2细胞, 于24h、48h及72h后采用MTT法检测细胞增殖抑制率;72h后收集各组肝癌HepG2细胞, 流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-PCR检测survivinmRNA表达。结果 MTT法检测显示,G-Rh2对肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并存在浓度和时间依赖关系; 流式细胞仪检测显示G-Rh2作用后, 细胞被阻滞于G0/G1 期, 随药物质量浓度的增加, 细胞凋亡率逐渐增加。RT-PCR结果显示,GRh2下调肝癌HepG2细胞survivinmRNA表达。结论 G-Rh2在体外对肝癌HepG2细胞有明显的增殖抑制和凋亡诱导作用,初步推断G-Rh2诱发肝癌细胞凋亡的作用与其对survivin基因表达的抑制有关。

关键词: 肝细胞癌;hepG2;Rh2; 凋亡

人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强免疫力等多种生物学活性。人参皂苷是人参中主要的活性成分。人参皂苷单体Rh2( G-Rh2) 是从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物, 在一些肿瘤细胞体外培养系中观察到其对肿瘤细胞增殖的抑制作用, 并初步探讨该过程与诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期等有关。而目前缺少关于G-Rh2对肝癌细胞增殖抑制及其相关分子机制的研究报道。本研究以人肝癌细胞株HepG2为研究对象, 观察不同浓度G-Rh2诱导肝癌细胞凋亡的作用, 并初步探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

G-Rh2由吉林大学分析化学教研室提供, 纯度大于99%; 1640培养基和新生小牛血清(FBS) 购自杭州四季青生物有限公司; MTT购自Sig-ma公司。survivin引物由上海生工生物技术公司合成,Trizol 试剂, MMLV逆转录试剂盒, PCR试剂盒均购自Invitrogen公司, 紫外凝胶显像仪(美国) 。

1.2 细胞来源及培养

人肝癌细胞系(HepG2) 细胞购自于上海中科院细胞库室, 经常规复苏后培养和维持在体积分数为10%FBS的1640培养液里,置CO2 培养箱( 37 , 5%CO2) 培养, 取对数生长期细胞经24h无血清培养后, 分组进行实验。

1.3 MTT法检测细胞生长抑制

取对数生长期细胞以密度为3*105/ml, 接种于96孔培养板、每孔100μl。细胞贴壁后随机分组, 空白组、G-Rh2( 5、10、20mg/ L) 组, G-Rh2( 10mg/L) 给药24、48、72h组。每一浓度均设3个复孔, 同时设有对照孔。培养结束前加MTT( 5g/ L) 15μll, 继续孵育4h后每孔加150μlDMSO, 震荡10min, 用酶标仪测定570nm各孔光吸收值( A值) 。计算细胞生长抑制率, 抑制率≥30%为细胞对该药敏感。细胞生长抑制率( %)= ( 1-加药组A值/ 对照组A值) *00%

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期

对数生长期细胞经0. 25%胰酶消化后传代接种于培养瓶中,每瓶细胞1*106, 24h后加药, G-Rh2终浓度为5mg/ L、10mg/L和20mg/L, 对照组加等体积PBS, 各瓶终体积为4ml, 72h后收集各组细胞, 用冷PBS( pH7. 2) 清洗2次, 70%的冷乙醇4 固定24h。用FACStarpous流式细胞仪检测, 计算凋亡率和各期细胞所占比例。

1. 5 T-PCR检测基因变化

对数生长期细胞按每瓶细胞1*106接种, 24h后向后两组细胞加药(分组同1. 4) , 继续培养72h后收集全部四组细胞,按Trizol 操作说明, 提取RNA, 紫外分光光度计定量。RNA样品经逆转录反应合成cDNA, 然后进行PCR扩增, 以GAPDH为内参, 观察survivinmRNA表达情况。survivin扩增产物为466bp: 上游引物为5’-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3’; 下游引物为5’-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3’。 GAPDH扩增产物为309bp, 上游引物为: 5’-GG2GAAACTGTGGCGTGAT-3’下游引物为: 5’-AAAGGTGGAG2GAGTGGGT-3’。PCR产物经1%琼脂糖凝胶系统电泳(含溴化乙啶) , 拍照鉴定和分析。

1.6 统计学处理

采用SPSS12. 0统计软件对数据进行处理, 使用x2检验进行统计分析。

2 结果

2.1 G-Rh2对HepG2细胞增殖的影响

对照组细胞体外生长活跃, 经5、10及20mg/ LG-Rh2作用后，HepG2细胞增殖均有不同程度受到抑制, 与阴性对照组比较差异具有显著性( P< 0. 01) , 且Rh2对肝癌HepG2细胞生长抑制影响呈剂量依赖性, 和时间依赖性。增殖抑制率随着G-Rh2剂量增加而增加;加用10mg/ LG-Rh2后24、48及72h的细胞增殖抑制率随时间延长而增加。如图1。

2.2 G-Rh2对HepG2细胞周期及凋亡率的影响

3种浓度的G-Rh2作用HepG2细胞72h后, 可影响细胞周期分布, G0/ G1 期和G2/ M期细胞百分比上升, S期细胞百分比下降, 细胞凋亡率随药物剂量增加而逐渐增加, 详见表1。

2. 3 G-Rh-2对HepG2细胞survivinmRNA表达的影响

Survivin和GAPDH扩增片段长度分别为466bp和309bp。5, 10, 20mg/ LG-Rh2组survivin表达抑制率为41. 02%, 61. 16%和88. 69%。对survivin基因表达抑制率随G-Rh2剂量增加而增加, 详见图2。

3 讨论

人参皂苷是人参的主要活性成分, 在人参皂苷单体中G-Rh2的抑瘤活性最强, 体内外实验结果表明G-Rh2时间和剂量依赖性地抑制宫颈癌、脑胶质瘤、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖, 且其诱导凋亡与抑制增殖呈正相关, 但目前未见G-Rh2对人肝癌细胞HepG2增殖抑制作用的研究。Kim等研究表明G-Rh2有诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡的作用。马文彬等应用流式细胞仪研究G-Rh2对S180肉瘤细胞周期移行的影响, 发现GS-Rh2能引起细胞周期阻滞于S期。为进一步探讨G-Rh2抑制细胞生长的机理, 我们检测了G-Rh2作用后HepG2细胞凋亡率(AR) 以及细胞周期变化。结果显示本实验结果表明G-Rh2可以使肿瘤细胞周期阻滞, G1 期细胞增多, S期细胞减少, G2/M期细胞相对增多, 抑制细胞G1期的RNA合成, 从而延缓肿瘤细胞的增殖, G-Rh2可使HepG2细胞G1 期阻滞, 不能进入S期, 阻滞G1 期细胞向S期的转化进程, 从而使G2/M期细胞相对增多。HepG2细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示: 在一定范围内, G-Rh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性和时间依赖性。

Survivin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白( inhibitionapoptosisprotein, IAP) , 在正常组织、终末分化组织中表达阴性, 而在绝大多数肿瘤组织中表达阳性, 与肿瘤的预后密切相关。其作用机制与IAP家族的其他蛋白相似, 系通过抑制caspase-3和7酶原的活性, 抑制细胞凋亡; 另外, Survivin还通过与纺锤体纤维的结合, 间接地抑制caspase酶对纺锤体的水解作用, 保护有丝分裂细胞器的完整性, 发挥抑制细胞的凋亡的作用。本实验结果证实, GS-Rh2能抑制肝癌HepG2细胞Survivin基因的表达, 而且随着药物浓度的增加, 对Survivin基因的表达的抑制作用也增加。G-Rh2在体外对肝癌细胞HepG2有明显的增殖抑制作用和凋亡诱导作用, 初步推断其对survivinmRNA表达的抑制可能是G-Rh2诱发肝癌细胞凋亡的主要原因之一。但对其作用机理仍需进一步的探讨。