人参皂甙-Rh2对Ara-c诱导HL60细胞增殖抑制和凋亡作用的影响

　　摘要: 目的 探讨人参皂甙单体Rh2(GS-Rh2)对阿糖胞苷( Ara-c)抗白血病作用的影响。方法 体外培养人髓性白血病细胞株(HL60)并随机分为三组, 其中Ara-c组加入终质量浓度分别为5. 0~ 40. 0Lg/ml的Ara-c, GS-Rh2组加入终质量浓度为4. 0~ 32. 0Lg/ml的GS-Rh2, 联合组加入终质量浓度为4. 0Lg/ml的GS-Rh2及上述质量浓度Ara-c。48h后采用MTT法测定三组HL60细胞的增殖抑制率( IR), 并计算半数抑制浓度( IC50)、合用指数( CI)、增效倍数及合并效应与期望合并效应的比值( q);倒置显微镜及常规瑞) 吉染色法观察细胞凋亡形态。

　　结果 Ara-c组、GS-Rh2组的IC50分别为32. 0、13. 0,联合组Ara-c的IC50为14. 5Lg/L,显著低于Ara-c组(P<0. 001);联合组CI为0. 76, 4. 0Lg/mlGS-Rh2对Ara-c的增效倍数为2. 21, Ara-c质量浓度为5. 0、10. 0、20. 0、40. 0Lg/ml时的q分别为1. 42、1. 39、1. 36、1. 21; 联合组细胞凋亡形态较其他两组明显。结论 GS-Rh2可提高HL60细胞对Ara-c的敏感性,减少Ara-c的临床用药剂量和毒副作用, 加强Ara-c的疗效; 此为临床治疗白血病提供了新的思路。

　　关键词: 人参皂甙-Rh2;阿糖胞苷; HL60细胞; 凋亡

　　阿糖胞苷( Ara-c) 为白血病患者化疗的首选药物, 作用机制之一是诱导白血病细胞凋亡, 但其毒副作用大, 在限定剂量范围内化疗效果欠佳。人参皂甙-Rh2( GS-Rh2)是人参中抗肿瘤活性的主要成分, 具有促进多种肿瘤细胞凋亡作用, 研究表明其可提高柔红霉素、长春新碱等抗肿瘤药物对白血病细胞的细胞毒性, 但有关其对Ara-c化疗作用的研究国内鲜见报道。2008年6月, 我们观察了GS-Rh2对Ara-c诱导人髓性白血病细胞株(HL60) 增殖抑制和凋亡作用的影响, 旨在为白血病的临床治疗提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Ara-c, GS-Rh2(相对分子质量为622. 88Da), 二甲基亚砜( DMSO), 噻唑蓝(MTT); HL60细胞株, RPMI-1640培养基, 小牛血清。

　　1. 2 实验方法

　　1. 2. 1 细胞培养与处理

　　将HL60细胞置于含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养液中,37℃ , 5%CO2孵箱中培养。细胞呈悬浮生长, 达80%左右时常规传代。取对数生长期HL60细胞制备成细胞悬液, 密度为3*105/m,l 接种于96孔培养板、每孔100Ll。6h后随机分为三组, Ara-c组加入终质量浓度分别为5. 0、10. 0、20. 0、40. 0Lg/ml的Ara-c, GS-Rh2组加入终质量浓度分别为4. 0、8. 0、16. 0、32. 0Lg/ml的GS-Rh2, 联合组加入4. 0Lg/ml的GS-Rh2及上述质量浓度的Ara-c。每一浓度均设4个复孔, 同时设有对照孔和调零孔, 各孔总体积均为200μl 。

　　1. 2. 2 细胞增殖抑制率测定及药物相互作用分析

　　1、细胞增殖抑制率( IR)测定: 上述各组加药48h后,采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率。用酶联免疫检测仪于570nm波长下测各孔的吸光度( A值), 每孔重复测定3次取平均值, 按下列公式计算: IR(%)=( 1-给药孔平均A值/对照孔平均A值) @100%,绘制浓度-IR曲线, 并记录50%抑制率时所对应的药物浓度( IC50)。2、药物相互作用分析: 根据各药物IC50计算出联合用药的合用指数( CI)及增效倍数。CI<0. 95表示两种药物呈协同作用, >1. 05表示呈

　　拮抗作用, 0. 96~1. 04表示两药物联合应用其作用方式为相加。并且根据各药物组作用48h后的抑制率, 按金氏公式分别判断Ara-c组与相应浓度联合

　　组之间的实测合并效应与期望合并效应的比值( q):

　　E代表该药物组抑制率。0. 85< q<1. 15表示该浓度的组合方式为两药作用单纯相加, q≥1. 15表明该组合方式为两药作用协同, q≤0. 85表示该组合方式是两药拮抗。

　　1. 2. 3 凋亡细胞形态观察

　　细胞同上分组及处理48h后用, 倒置显微镜照相, 记录细胞形态学变化收集细胞, 离心涂片, 瑞) 吉染色, 进一步观察凋亡细胞形态。

　　1. 3 统计学方法

　　SPSS11. 0软件包进行统计学处理。所有数据用x ±s表示, 行计量资料t检验, 检验水准›=0. 05。

　　2 结果

　　2. 1 三组HL60细胞增殖抑制情况

　　单独应用Ara-c、GS-Rh2对HL60生长均有明显抑制作用, 在测定浓度范围内IR具有明显剂量依赖性; 与GS-Rh2合用后, Ara-c对HL60细胞的抑制作用增强(P<0. 001), 三组抑制率见图1、2。Ara-c组、GS-Rh2组的IC50分别为32. 0、13. 0, 联合组Ara-c的IC50为14. 5Lg/L, 显著低于Ara-c组(P<0. 001)。

　　2. 2 药物相互作用

　　联合组CI为0. 76, 4. 0Lg/mlGS-Rh2对Ara-c的增效倍数为2. 21。Ara-c质量浓度为5. 0、10. 0、20. 0、40. 0Lg/ml时的q分别为1. 42、1. 39、1. 36、1. 21。

　　2. 3 凋亡细胞形态

　　药物作用48h后, 各组HL60细胞变长, 膜鼓起并逐渐脱离细胞, 细胞核固缩呈凝块状, 并沿核膜边缘聚集, 碎裂呈大小不等的圆滴状小体, 形成凋亡小体, 且联合组变化较其他两组为著。

　　3 讨论

　　Ara-c是治疗急性白血病等恶性血液系统疾病的主要作用机制是调节Bc-l 2蛋白表达, 诱导白血病细胞凋亡。近年大量临床实践表明, 大剂量Ara-c虽可极大提高白血病患者缓解率和长期生存率,但骨髓抑制、黏膜炎、肺损伤、小脑神经毒性及肝、肾、心脏损害等药物毒副作用也随之增大。增强Ara-c抗肿瘤作用并降低其毒性已成为白血病治疗的热点课题。

　　GS-Rh2可呈剂量依赖性抑制白血病细胞增殖,并且诱导细胞凋亡。可能机制: 使肿瘤细胞增殖周期阻滞于S期和M期, 抑制DNA复制和转录及蛋白质合成, 从而使肿瘤细胞增殖减慢或停止; 下调突变型p53表达, 促进肿瘤细胞调亡; 作为一种外源性分化诱导剂使肿瘤细胞逆转成正常细胞; 提高IL-2活性, 提高巨噬细胞吞噬功能和NK细胞杀伤活性。此外, Rh2还可一定程度提高肿瘤对多种化疗药物敏感性, 是天然的生化调节剂, 具有广阔的应用前景。本研究显示, 与Ara-c组比较, 联合组IC50显著降低, IR显著升高, 细胞凋亡显著增加, 提示GS-Rh2能提高HL60细胞对Ara-c的敏感性。本资料还显示, GS-Rh2与Ara-c具有协同作用而非简单的叠加效应( CI为0. 76, 增效倍数为2. 21), 原因可能是二者可通过不同途径诱导肿瘤细胞凋亡。

　　综上所述, GS-Rh2可提高HL60细胞对Ara-c的敏感性, 减少Ara-c的临床用药剂量和毒副作用, 加强Ara-c的疗效; 此为临床治疗白血病提供了新的思路。