人参单体Rh2对肺腺癌耐药细胞促凋亡作用的研究

　　人参单体Rh2对肺腺癌耐药细胞促凋亡作用的研究

　　胡　硕1,胡成平1,梁昌华1,黄柏英2

　　(1.中南大学湘雅医院,湖南长沙410008;　2.中南大学细胞培养中心,湖南长沙410008)

　　〔基金项目〕湖南省科技厅科研基金课题(03SSY3054)。

　　〔作者简介〕胡　硕(1971-),女,湖南郴州人,医学博士,主治医师,主要从事肿瘤核医学研究。

　　出处：湖南中医学院学报 2005年4月第25卷第2期

　　〔摘要〕目的探讨人参单体Rh2对肺腺癌耐药A549 DDP细胞的促凋亡作用。方法用MTT法分别检测顺铂和Rh2对A549细胞、A549 DDP细胞的抑制率(IC)。将Rh2作用于A549 DDP细胞,Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞跨膜电位(Δψ)。结果顺铂对A549细胞、A549 DDP细胞的IC50分别为24μmol/L、325μmol/L,耐药指数为13.54。Rh2>10μmol/L时,对A549 DDP细胞有明显抑制作用,且与Rh2的浓度有一定的依赖关系。Rh2作用后A549 DDP细胞核缩小或变形,荧光成团块分布,有凋亡小体形成;细胞线粒体跨膜电位显著性降低(P<0.01)。结论Rh2能促使A549 DDP细胞凋亡,其可能是通过降低细胞的线粒体跨膜电位来诱导细胞凋亡。

　　〔关键词〕人参单体Rh2;凋亡;肺腺癌细胞;细胞跨膜电位;耐药

　　〔中图分类号〕R 285.5　〔文献标识码〕A　〔文章编号〕1000—5633(2005)02—0014—03

　　The Effects of Rensenoside Rh2 on Lung Adenocarcinoma Cells

　　Hu Shuo, Hu Chengping, Liang Changhua, et al

　　(Dept.of NuclearMedicine, Xiangya Hospital, Central SouthUniversity, Changsha 410008)

　　〔Abstract〕ObjectiveTo explore the effects of Gensenoside Rh2 on lung adenocarcinoma cells.Meth-odsThe method ofMTTwas applied to test the resistance of cisplatin and Gensenoside Rh2 to A549 cellsand A549DDP cells respectively. Cellular morphology was observed under fluorescence microscope. Mem-brane potential ofmitochondrion (Δψ) was inspectedwith flowcytometry.ResultsIC50of cisplatine toA549cells and to A549DDP cells were 24μmol/L and 325μmol/L respectively. When Rh2>10μmol/L,A549cells and A549DDP cells were restrained obviously. Observed under fluorescence microscope, fluorescencewas distributed uniformly onA549DD cell nucleuswithout treatment.After treated byRh2, fluorescencewasconglomerated like grain on the cell nucleus.Many cell nucleuswere shrunkor distorted.Δψof cells treatedby Rh2 were markedly lower than that without treatment,P<0.01.ConclusionsGensenoside Rh2 can

　　cause A549DDP cells apoptosis by reducingΔψof cells.

　　〔Key words〕Gensenoside Rh2; Apoptosis; Lung adenocarcinoma cells;Δψ; Resistance

　　化疗是治疗晚期肺癌患者的重要手段,临床上化疗失败的主要原因是肺癌细胞对抗癌药物产生耐药。寻找既能有效克服肿瘤细胞的耐药,毒副作用又小的抗癌药物,是目前临床上急需解决的问题。传统的中草药中不少药物因毒副作用小且有一定的抗肿瘤作用,而日益受到研究者们的关注。本研究拟探讨人参单体Rh2对肺腺癌A549DDP细胞的促凋亡作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　细胞　肺腺癌A549细胞由中南大学细胞培养中心提供;A549DDP细胞由中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室提供。

　　1.1.2　药品　顺铂(cisplatin,DDP)购于山东齐鲁制药厂,人Rh2由吉林大学基础医学院生化研究室提供。

　　1.1.3　试剂　MTT、Hoechst33258、Rh—123均购自Sigma公司。

　　其它试剂由中南大学现代测试中心提供。

　　1.1.4　仪器　低温高速离心机、CO2细胞培养箱、荧光显微镜、酶标仪等由湘雅医院中心实验室提供,流式细胞仪由湘雅医学院遗传实验室提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　DDP或Rh2对细胞的抑制率　用MTT法计算DDP或Rh2对A549细胞和A549 DDP细胞的生长抑制率(IC)。经预实验选择0.1、1.0、10、20、50、100、500μmol/L不同浓度,每种浓度设5个复孔。根据下列公式(1)计算顺铂对细胞的半效抑制率(IC50),根据公式(2)算耐药指数(RI)。将A549DDP细胞分成2组,对照组细胞加生理盐水,实验组细胞加入能有效抑制细胞的Rh2,作用48 h后进行后述指标检测。细胞生长抑制率(IC)=1-实验组A值-空白组A值对照组A值-空白组A值×100% (1)耐药指数(RI)=耐药细胞系的IC50亲代细胞系的IC50(2)

　　1.2.2　荧光染色观察细胞形态　细胞按上述实验分组药物干预后,消化细胞,1 000 r/min,离心10min,用PBS洗涤重悬,加入60μg/mL Hoechst33258,约10 min后,荧光显微镜下观察,拍照;计数200个细胞,计算凋亡细胞百分率。实验重复2次。

　　1.2.3　流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位(Δψ)　细胞按上述实验分组药物干预后,消化细胞,1 000 r/min,离心10min,用PBS洗涤重悬,加入20μmol/L的Rh123染液,37℃避光染色30 min,PBS洗涤2次,重悬后在流式细胞仪上检测细胞Δψ,激发波长488 nm,吸收波长525 nm。

　　1.2.4　统计处理　数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较用单因素方差分析,用Excel软件完成统计学处理。以P<0.05判断有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　DDP、Rh2对细胞的抑制率

　　DDP作用48 h后,A549 DDP及A549细胞的IC50分别为325μmol/L、24μmol/L,RI为13.54,≤10μmol/L的Rh2对A549及A549 DDP细胞无明显抑制作用,IC<5 %(P>0.05);当Rh2≥20μmol/L时,对两种细胞有明显抑制作用(P<0.05),且随着浓度的增加,Rh2对A549 DDP细胞的抑制率明显增强,见图1。

　　2.2　荧光显微镜观察细胞核形态

　　Hoechst33258染色后,荧光显微镜下可见对照组的细胞核圆而大,细胞核形态正常,染色质分布均匀,表现为弥散均匀的荧光;细胞凋亡核占(6.13±0.98)%。实验组有大量固缩变形的细胞核,染色质浓缩、聚边,表现为浓染致密的荧光颗粒,细胞核缩小变形,有凋亡小体形成;细胞凋亡核占(59.46±1.22)%,与对照组比较,P<0.01。见图2。

　　2.3　流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位对照组的A549 DDP细胞Δψ维持正常水平,而实验组的A549 DDP细胞Δψ明显降低,在正常峰之前出现一个Δψ明显降低的新的细胞亚群(图略),与对照组比较有显著性差异,P<0.01,见图3。

　　3　讨论

　　肿瘤耐药是目前临床上急需克服的难题,许多化学药物被证实具有抗癌作用,但这些药物在体内要达到体外抗癌实验的有效浓度需要的剂量太大,不能在临床中广泛应用。近年来学者们发现人参提取物、人参皂苷等可以直接杀伤肿瘤细胞。Choi等[1]研究了人参皂苷包括总苷、PDG、PTG、Rb1、Rb2、Rc、Rg1、Rc能否提高两种急性淋巴细胞性白血病细胞(AML—2/D100细胞和AML—2/DX100细胞)的化疗敏感性和药物积累,发现PTG对两种细胞均有毒性。Yun[2]则通过流行病学研究,发现高丽参可预防和抵抗非器官特异性癌症,食用人参者患胃癌、肺癌的相关风险率(RR)降低,而这种预防和抗癌特性主要是由于Rg3、Rg5、Rh2的作用。Yun等[3]研究究了包括Rh2在内的4种人参皂角苷的抗癌效果,发现Rh2是人参中抗癌的有效成分,它有降低肺癌发生率的倾向性。

　　本实验结果显示,A549 DDP细胞虽然对顺铂的耐药性显著强于敏感的A549细胞,大于10μmol/L的Rh2对这两种细胞均有明显抑制作用,且这种逆转作用呈剂量依赖性。Hoechst33258染色后,对照组细胞核染色质分布均匀,荧光分布正常,实验组中,A549 DDP细胞核染色质聚集增浓,荧光团块状分布,并有特征性凋亡小体出现。说明Rh2能诱导A549DDP细胞凋亡,与文献报道一致。

　　发掘高效低毒的抗癌剂,中草药具有极大的优势,应用前景广阔,但中药药理作用广泛,药物成分复杂,很多中药抗癌机制不明确。Fei等[4]发现Rh2能诱导恶性黑色素瘤A375—S2细胞凋亡而抑制其增殖,且呈浓度和时间依赖性,其诱导凋亡是由Caspase—8和Caspase—3通路实现的,但他认为其他凋亡通路也可能与Rh2诱导凋亡有关。周桂华等[5]报道Rh2对前列腺癌PC—3M细胞有明显的抑制作用,而且随着Rh2浓度的增加,其对PC—3M细胞的抑制作用也增强,Rh2的这种抑制作用可能是由于其抑制了肿瘤细胞的DNA复制和转录,使肿瘤细胞的增殖减慢或停止。Δψ的崩解是细胞凋亡的特异性早期指标之一,Δψ对维持线粒体功能具有重要意义,一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会释放促凋亡物质等一系列变化,进入不可逆的凋亡过程[6]。本研究中,对照组的细胞Δψ维持正常水平,而实验组的细胞Δψ明显降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),说明Rh2对A549 DDP细胞的促凋亡作用可能是通过降低乃至崩解细胞的Δψ来实现的。对于Rh2是如何由线粒体凋亡通路最终引起细胞凋亡的,作者将作后续报道。

　　参考文献:

　　[1]　Choi CH, Kang G, Min YD.Reversal of P-glycoprotein-medi-ated multidrug resistance by protopanaxatriol ginsenosides fromKorean red ginseng[J].Planta Med,2003,69(3):235—240.

　　[2]　Yun TK. Experimental and epidemiological evidence on non-organ specific cancer preventive effect ofKorean ginseng and i-dentificationof active compounds[J]. Mutat Res,2003,523—

　　524:63—74.

　　[3]　Yun TK,Lee YS,Lee YH.Anticarcinogenic effect of panaxginseng C.A. Meyer and identification of active compounds[J].J Korean Med Sci,2001,16supopl:16—18.

　　[4]　Fei XF,Wang BX,Tashiros,et al.Apoptotic effect of ginseno-side Rh2 on human malignant melanoma A375—S2cells[J].Ac-ta Pharmacol Sin,2002,23(4):315—322.

　　[5]　周桂华,孟　艳,李　扬,等.人参单体皂苷Rh2对前列腺癌细胞株抑制效应研究[J].白求恩医科大学学报,2001,27(6):595—597.

　　[6]　Hengartner M O. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature,2000, 407(12): 770—776.