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20_S_人参皂苷Rh2对人结肠癌细胞增殖和周期的影响

2014-08-04

抗癌健康网

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导读:摘要:目的 研究20(S)-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao--2和HT-29细胞增殖及周期的影响。

  李秋影 炎璐璐 马晓慧 张莉华 张兰兰 郭治昕

  (1. 天津中医药大学,天津300193;2. 天津天士力研究院药理毒理所,天津3004410)

  摘要:

  目的 研究20(S)-人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao--2和HT-29细胞增殖及周期的影响。

  方法 采用荧光微孔法测定20(s)--人参皂苷Rh2对人结肠癌Cacao-2、HT-29细胞增殖的影响:利用显微镜观察给药后HT-29细胞形态变化:流式细胞术分析20(s)-人参皂苷Rh2对HT-29细胞周期分布的影响。

  结果 20(S)-人参皂苷Rh2对Caco-2、HT-29细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性:20(S)-人参皂苷Rh2作用48h后,对HT-29、Caco-2细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为19.68、26.79μg/ml;流式细胞分析结果现实,与对照组细胞相比,20(S)-人参皂苷Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例,增加D期细胞比例。

  结论 20(S)-人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞增殖,主要原因是阻滞细胞处于S期

  关键词: 20(S)-人参皂苷Rh2:HT-29:Caco-2:细胞增殖:细胞周期

  中图分类号:R996 文献标识码:A 文章编号:1001-1528(2001)11-1874-05

  人身为五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.meyer的干燥根,是已有几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明,人参中包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分,具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性。人参皂苷Rh2作为人参中一类主要生物活性成分,在癌症的治疗方面具有较强的活性,其中一人参皂苷-Rg3为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市。大量研究表明,人参皂苷Rh2也同样具有较好的抗癌活性,如通过抑制端粒酶活性从而诱导肝癌SMMC-7721细胞分化、通过介导细胞内Caspase一类半肽氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2细胞的增殖并诱导凋亡以及逆转耐药的白血病细胞等。药代动力学研究表明,人参皂苷-Rh2主要在肝、胃肠道分布;并通过线粒体途径包括P53、CASP5等多靶点诱导结肠癌SW480细胞凋亡,国内也有文献初步报道人参皂苷Rh2可抑制人结肠癌细胞株SW620和LOVO生长。从结构上,人参皂苷Rh2可分为S型和R型的构象,其中20(S)-人参皂苷Rh2单体(20(S)-G-Rh2)是植物中分离的主要构型。但20(S)-G-Rh2单体对人结肠癌细胞Ht-29和Caco-2的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20(S)-G-Rh2对人结肠癌Caco-2和Ht-29细胞增殖及对周期的影响,以期为新药研发和临床治疗结肠癌提供理论依据。

  1 材料和仪器

  20(s)-G-Rh2(天津天士力药物研究院现代中药研究所,纯度为90%):DMEM培养基(GIBCO-BRL公司);胎牛血清(G1BCO-BRL公司);二乙酸荧光素Flourescein Diacetate,FDA(Sigma);Cell Cy-cle Phase Determination Kit(Cayman Chemical Com-pany);流失细胞仪FACSCcalibur(Bechman Dickson公司);Caco-2、HT-29细胞由西河医科大学基础医学细胞中心引进,由本实验室传代培养;

  2 方法

  2.1 细胞培养于传代 将HT-29和Caco-2细胞至于37℃,饱和湿度5%CO2培养箱中常规培养,均用含10%热灭活胎牛血清,1%的抗生素(青霉素100mg/L和链霉素100mg/;)的DMEM完全培养基。细胞呈单层生长,达80%左右融合时,采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1:1)混合消化液(胰酶)消化传代,取生长对数期的细胞用于实验。

  2.2 荧光微孔法监测细胞增殖实验 将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞,用胰酶消化,用DMEM完全培养基配成单个细胞悬液,调整细胞浓度为5×104个/mL。接种于96孔培养板中,每孔接种100μL,于37℃,饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后换液,空白对照组为DMEM培养基,实验组每孔加入50-12.5μg/mL5个浓度的20(2)-G-Rh2(用DMEM培养基配置)处理48h,每个浓度组及对照组君左3个平行孔。48h后吸弃板中培养基,加入100μL含2.5μg/mL二乙酸荧光素的PBS重复洗2变,甩去PBS并吸弃板中剩余的PBS,Leica DM16000B 电动倒置荧光相对显微镜在激发和发射波长分别为488nm和530nm下,测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率,并求算出半数抑制浓度(IC50),实验重复3次。细胞生长抑制率%=(1-给药组荧光强度/对照组荧光强度)×100%

  2.3 显微镜观察细胞形态学变化

  将对数生长期的HT-29、Caco-2细胞,用胰酶消化,用完全培养基配成单个细胞悬液,调整细胞浓度为5×104个/mL,每孔2mL细胞悬液细胞悬液种于放置盖玻片的6孔板中,培养细胞爬片生长。培养24h,带细胞在盖玻片上贴壁良好后,加入0.2mL20μg/mL20(S)-G-Rh2处理细胞48h,在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

  2.4 流式细胞仪检测细胞周期

  将对数生长期的HT-29细胞,用胰酶混合消化液消化,用完全培养基配成单个细胞悬液,调整细胞浓度为5×104 个/mL。接种于6孔培养板中,每孔接种2mL,于37℃,饱和湿度为5%CO2培养箱中,每孔接种2mL,于37 ℃,饱和湿度5%CO2培养箱中培养24h后,换无血清的DMEM培养液同步化24h,加不同浓度的20(S)-G-Rh2处理细胞24h,加不同浓度的20(S)-G-Rh2处理细胞24h后,经胰酶(不加EDTA)消化,Assaybuffer洗2遍,(3000rpm,3min),加入固定液固定2h,上机前离心弃去固定液,加入100mg/LR-Nase和5g/L碘化丙啶(PI)染色剂,染色避光30min,流式细胞仪检测细胞周期变化。

  2.5 统计学处理

  用SPSS10.0软件完成统计学处理,软件完成统计学处理,实验数据以均数±标准差即(X(-)±S)表示,组间分析比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

  3. 结果

  3.1 20(S)-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖的影响 二乙酸荧光素(FDA)可透过细胞膜并脱脂释放荧光素积累在活细胞中,激发和发射波长分别为488nm和530nm,常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA为荧光指标剂建立了微孔板法进行20(S)-G-Rh2对人结肠癌细胞Caco-2和HT-29的增殖影响研究。结果显示,20-(S)-G-Rh2对Caco-2和HT-29细胞增殖具有明显的抑制作用,其抑制作用随药物浓度而增强,呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29和Caco-2细胞的半数抑制率(IC50)分别为19.68μg/mL和25.79μg/mL。(结果如表1,图1、2)。

  3.2 显微镜观察细胞形态学变化

  20μg/mL 20(S)-G-Rh2处理48h后的HT-29细胞较空白对照组细胞成群贴壁生长、细胞透亮,折光性好。而给药组细胞之间互相脱离,颜色加深,贴壁细胞数量减少,细胞轮廓消失。(见图3)。

  3.3 20(S)-G-Rh2对HT29细胞周期的影响

  20(S)-G-Rh2处理24h后细胞,用流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞数。结果显示;20μg/mL 20(S)-Gh2处理24h后HT-29细胞在细胞周期的分布发生娴熟性的变化。对照组G0/G1期、G2/M期、G2/M期、S期细胞比例分别为(76.78±4.0)%、(3.61±2.1)%和(19.60±3.59)%、(0.8±1.21)%及(54.54±2.17)%:给药组20(S)-G-Rh2的G0/G1期和G2/M期细胞比例明显的减少,S期细胞比例升高,与对照组有显著性差异(P<0.05),具有统计学意义,(建表2,图4)。

  4 讨论

  结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤,临床主要以手术治疗并术后放疗和化疗为主要治疗手段,但对晚期效果不佳。人参皂苷是人参的主要生物活性成分,人参皂苷单体中G-Rh2具有抑癌活性,并对正常组织毒性甚低。目前体内外实验结果表明:通过对细胞周期的影响,诱导细胞凋亡,从而时间和剂量依赖性的抑制多种多种肿瘤细胞的增殖。但20(S)-人参皂苷Rh2对人结直肠癌细胞Caco-2和HT-29的研究还未见到报道,因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞,考察20(S)-G-Rh2对人结肠癌细胞的凋亡及细胞周期的影响做初步的探究。本研究结果表明,20(S)-G-Rh2可抑制人结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞生长,且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性,其IC50分别为19.68和26.79μg/mL。显微镜下现实:当一定剂量的20(S)-G-Rh2作用48h后的人结肠癌细胞HT-29出现明显的细胞死亡形态。肿瘤的发生是一个多步骤、多因素、多阶段改变的过程,其中细胞周期调控失控被认为是肿瘤发生的重要机制。细胞凋亡可发生在细胞周期的各个时相。采用流式细胞分析技术进行细胞周期研究,结果显示:20(S)-G-Rh2能显著减少HT-29细胞的G0/G1期和G2/M期细胞比例,增加S期细胞比例,说明20(S)-G-Rh2可阻滞人结肠癌细胞HT-29于S期。与β-拉帕醌阻滞结肠癌细胞SW480、SE620和DLD-1于S期进而导致凋亡的机制相同。综上所述,20(S)-G-Rh2可抑制人结肠癌Caco-2和HT-29细胞增殖,其抑制作用主要是由于其可阻滞细胞处于S期,S期为DNA辅助器,大量的DNA在此期间解旋复制,暴露活性位点,为化疗药物提供更多的靶点。20(S)-G-Rh2可阻滞结肠癌细胞于S期导致凋亡,可与阻滞细胞于G0/G1或G2/M期的化疗药物联合治疗结肠癌。但其确切的分子机制将有待于进一步探讨,20(S)-人参皂苷-Rh2单体将在临床防止肿瘤方面具有广泛的应用前景。

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