人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的研究

　　人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的研究

　　【摘要】目的: 研究人参皂甙Rh-2( G-Rh2) 诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用。方法: 应用流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳检测G-Rh2处理前后Hep-2细胞的凋亡情况, 并应用SP免疫组化法检测药物处理前后相关基因产物Bax、Bcl-2蛋白的表达, 观察G-Rh2对喉癌Hep-2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞周期的影响。结果: ( 1) G-Rh2具有诱导凋亡作用, 且呈量效、时效关系, 细胞凋亡率随G-RH2浓度及作用时间的增加而升高, 并可将细胞周期阻滞于G0/ G1 期。( 2) G-Rh2处理Hep-2后, Bax表达上调, Bcl-2在G-Rh2处理前后无明显变化。结论: G-Rh2对体外培养的Hep-2细胞具有诱导凋亡的作用, 其机制可能与上调Bax的表达及细胞周期阻滞有关。

　　【关键词】人参皂甙Rh-2; 喉癌; 细胞凋亡; 细胞周期

　　喉癌是常见的耳鼻咽喉恶性肿瘤, 占耳鼻咽喉各种恶性肿瘤的第三位。目前, 喉癌的治疗仍以手术为主, 然后辅以化疗以延长患者生存率。而大量抗癌药物是通过诱导细胞凋亡而发挥其细胞毒作用的。所以, 促进肿瘤细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标。

　　人参皂甙Rh2( Ginsenoside-Rh2, G-Rh2) 是近年来从人参中分离出来的一种有效成分, 属于人参二醇型四环三萜类低糖链皂甙单体, 体内、外实验表明, 它通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖, 并证明其对正常组织毒性很低。本实验以人喉癌Hep-2细胞株为实验对象, 研究G-Rh2通过诱导凋亡对Hep-2细胞株的抑制作用, 从而为喉癌的临床治疗提供更多的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1. 1 细胞株及细胞培养

　　人喉癌细胞株购于北京同仁医院耳鼻咽喉研究所, 培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中( 含100IU/ ml 青霉素和0. 1mg/ml 链霉素) , 于37# 、5%CO2恒温培养箱中培养, 细胞呈贴壁生长, 达80%左右时传代。传代用0. 25%的胰蛋白酶消化。

　　1.2 药品与试剂

　　G-Rh2购自吉林大学医学部天然药物化学研究室, 制成针剂, 浓度为20g/ L、纯度∃98%, 用时以RPMI1640培养液稀释为不同浓度。琼脂糖和吖啶橙购自Sigma公司, 兔抗Bax 多抗及鼠抗Bcl-2单抗购自武汉博士德公司, 核糖核酸酶(RNase)和碘化丙啶( PI) 购自华美生物试剂公司。

　　1. 3 实验方法

　　1. 3. 1 流式细胞仪检测G-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析: 取对数生长期的Hep-2以1%105cell/ cm2接种于培养瓶中, 贴壁培养24小时后弃去上清, 处理组加入含不同终浓度( 10、20、40、80mol/L) G-Rh2的培养液, 对照组加入等量培养液。培养24小时, 经0. 25%胰蛋白酶消化后, 收集约1%106个细胞。PBS洗涤, 制成单细胞悬液, 用70%的冰乙醇4℃固定12h。于PI 一步染色液中染色30min后做流式细胞仪分析。

　　1. 3. 2 流式细胞仪检测G-RH2诱导凋亡的时效关系: 细胞取样、计数、培养同上。根据以往采用MTT法检测G-Rh2对Hep-2细胞的生长抑制作用的结果,其半数抑制浓度( IC50) 为38. 6μmol/ L, 因此我们选择40mol/ L( IC50的近似值) G-Rh2分别作用0、12、24、48h后, 检测凋亡率。

　　1. 3. 3 琼脂糖凝胶电泳法: 细胞取样、计数、培养、分组同上。37℃培养24h后终止培养, 分别收集各组悬浮和贴壁细胞至1. 5mlEP管中, 每管用细胞裂解液500μl 重悬细胞后加蛋白酶K至终浓度100μl/ ml,50℃水浴3小时。经酚/ 氯仿抽提一次, 2. 5倍体积的无水乙醇沉淀DNA。1. 2%的琼脂糖凝胶电泳约1小时, 比较各组DNA电泳带型特点。

　　1. 3. 4 免疫组化: 细胞取样、计数同上, 接种于置有小盖片的24孔培养板中, 实验组加入含G-Rh240μmol/ l的培养液, 对照组加入等量RPMI1640培养液。每组设3个复孔, 于37℃ 孵箱内培养48小时后, 收集细胞, 制备细胞涂片。采用SP免疫组化法检测Bax 和Bcl-2的表达, DAB显色, 苏木素浅染, 光镜下观察, 以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

　　1. 4 统计处理 采用X2检验进行统计分析。

　　2 结果

　　2. 1 G-Rh2诱导Hep-2细胞凋亡的量效、时效关系

　　采用流式细胞仪检测凋亡细胞, 各处理组细胞凋亡率随G-Rh2浓度增高而递增, 见表1。在40mol/ l G-RH2作用下, 不同时间处理组细胞凋亡率随处理时间的延长而增高, 见表2。

　　2. 2 G-Rh2作用后细胞周期变化

　　用流式细胞仪检测各期细胞数( 每组检测10000个细胞) , 结果证明G-Rh2处理Hep-2细胞24h后, 对G1期细胞的阻滞作用非常明显, 见表3。

　　2. 3 琼脂糖凝胶电泳结果

　　细胞凋亡时, 随着核酸内切酶的活化, DNA降解成寡聚核小体, 这些降解片段均为180-200bp的倍数, 通过电泳可形成典型的“梯状带”。无凋亡时, DNA未被降解, 电泳形成单一的条带位于点样孔附近。本实验结果显示: 20μmol/ l、40μmol/ l、80μmol/ l G-Rh2组显示“阶梯状”条带( 即“ ladder”) , 对照组及10mol/ l G-Rh2组未见“ ladder”(图1) 。

　　2. 4 免疫组化检测结果

　　免疫组化结果显示, Bax阳性产物位于胞浆, 对照组Bax表达呈弱阳性, G-Rh2处理后的细胞Bax 表达水平提高( 图2) 。Bcl-2阳性表达可见于胞膜及胞浆, 对照组和G-Rh2处理组均呈阳性表达, 二者无显著性差异( 图3-4) 。

　　3. 讨论

　　肿瘤的发生发展与细胞凋亡异常有极其密切的关系, 因此细胞凋亡成为临床上体现对肿瘤实施化疗效果的一个重要指标。国内外许多学者通过体内外实验证实G-Rh2具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用, 但喉癌细胞方面则鲜见报道, 本实验旨在阐述G-Rh2诱导喉癌细胞凋亡的机理, 为喉癌的临床治疗提供更多的实验依据。

　　本实验在采用流式细胞仪对G-Rh2诱导Hep-2细胞凋亡的研究中发现: Hep2细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示: 在一定范围内, GRh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性。根据Anodrew等的观点, 细胞死亡是由正常的细胞周期改变引起的。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关, 细胞阻滞与哪一期, 凋亡就发生在哪一期。本实验结果表明: 各实验组G1期细胞数量增多, 说明G-Rh2能阻滞G1期细胞向S期移行。在药物作用下,部分肿瘤细胞发生凋亡, 未发生凋亡的部分细胞进入S期。这一结果与樊文华等在研究G-Rh2诱导肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用时所得结果一致。

　　在细胞凋亡的调控因子中, Bcl2基因家族是重要成员, 此家族共有三种基因: Bcl-2、Bax、Bcl-x基因, 三者形成了一个凋亡调控系统: 1、当Bax 同源二聚体形成, 便诱导凋亡;2、随Bcl-2蛋白表达量上升, 越来越多的Bax二聚体分开, 与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体, 从而“ 中和”了Bax-Bax诱导凋亡的作用, 即细胞内Bcl-2与Bax 的比例调节了凋亡的发生; 3、而当Bcl-xS存在时, 优先与Bcl-2形成异源二聚体, 而使游离的Bax得以形成同源二聚体, 便诱导了凋亡。通过本实验结果, 我们认为G-Rh2在一定浓度范围内可诱导细胞凋亡, 此作用与上调Bax蛋白有关。Bax 表达增强, 形成Ba-Bax 同源二聚体的量增加, 从而诱导凋亡。Bcl-2是否参与诱导Hep-2凋亡, 根据本实验结果无法确定。这一结果与韩国学者的报道一致。

　　通过以上结果, 说明G-Rh2具有诱导Hep-2细胞凋亡的作用. 其诱导凋亡作用可能与Bax 表达上调以及阻滞细胞于G1 期有关。