人参皂甙单体Rh2对人喉癌细胞株Hep-2抗增殖作用

　　人参皂甙单体Rh2对人喉癌细胞株Hep-2抗增殖作用

　　[关键词]　喉肿瘤(Laryngeal Neoplasms);人参皂甙(GINSENOSIDE)

　　人参皂甙单体R h 2 (ginsenoside Rh2 ，G – Rh2)是近年从人参中提取的一种新的有效活性成分。研究表明它对卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、白血病和神经胶质瘤等肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用。探讨G – Rh2 对喉癌细胞的作用及其机制，现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 细胞培养。喉鳞状细胞癌细胞株Hep - 2 购自北京市耳鼻咽喉科研究所，细胞用含1 0 % 灭活胎牛血清的RPMI1640培养基培养，每周传代2次。

　　1.2 M T T 试验。取对数生长期H e p - 2 细胞，接种培养板中5 ×103/孔，每2 4h 换培养液。培养2 4、4 8、7 2 h 后，观察细胞形态变化。每孔加入MTT溶液10 µl，培养4 h后弃上清，加入D M S O 溶液1 0 0 µ l ，震荡后室温静止1 0 m i n ，然后用酶标仪于570n m 处测定吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

　　1.3　流式细胞仪检测细胞周期变化。用G-Rh2 30 µg/ml处理Hep - 2 细胞2 4 h ，常规处理，碘化丙啶染色，流式细胞仪分析结果。

　　1.4　免疫组化S A B C 法检测p27蛋白的表达。按SABC 试剂盒说明进行常规免疫组化染色，封片后光镜观察。每张切片随机取1 0 个高倍镜视野(400×)，以CIAS - 1000 型全自动彩色细胞图像分析系统分析计算平均值，灰度值随表达量的增多而减少。

　　2 结果

　　2 . 1 　G-Rh2对Hep -2 细胞形态的影响。不同浓度的G-Rh2对Hep -2 细胞共同培养2 4 、4 8、7 2h 后，倒置显微镜下观察。对照组细胞贴壁良好，呈梭形或多边形生长，细胞透明、折光性好、状态佳(图1 A)。实验组：G - Rh2 2 0 µ g / m l 培养细胞减少，形态欠规则，梭形或圆形生长，胞浆内变化不明显(图1 B)。G-Rh2 40µ g / m l 细胞培养生长缓慢，胞内可见黑色颗粒物质，部分细胞坏死，漂浮(图1C)。

　　2.2 G-Rh2对Hep -2 细胞的生长抑制作用。G-Rh2对Hep -2 细胞生长抑制作用明显，实验范围内最大抑制率达82.8% ，且抑制作用随药物浓度增加，作用时间延长而增强(除外1µg/ml组别)，呈现剂量、时间依赖性作用(表1)。

　　2.3　细胞周期分析。G-Rh2 作用Hep -2细胞2 4 h ，细胞阻滞于G1期的积累作用非常明显，G2 /M期细胞比例没有明显变化，凋亡细胞没有明显变化(表2)。

　　2.4 　G-Rh2对Hep -2 蛋白表达的影响。实验组Hep -2 细胞中p27蛋白表达明显上升。

　　3 讨论

　　许多学者已经证实，G-Rh2 在体内、外能够抑制肿瘤或肿瘤细胞生长、增殖。但G-Rh2能否抑制喉癌细胞Hep -2的生长、增殖，国内、外鲜见报道。本实验表明G - R h 2 可诱导细胞形态学发生改变，影响细胞的增殖活力，抑制其生长，呈剂量、时间依赖性作用(除外1µ g / m l 组)，实验范围内最大抑制率可达82.4%。这与周桂华等的报道结果相近。

　　流式细胞仪检测显示G-Rh2 作用Hep -2细胞24h 后，细胞阻滞于G 1 期的积累作用非常明显，而凋亡细胞没有明显变化。其中G 2 / M 期两组间比较，显著性差异不明显，无统计学意义。提示G-Rh2 对G 2 / M 期细胞周期没有影响，与传统的抗肿瘤药物作用于G 2 / M 期的抗肿瘤机制不同。G 1 、S 期细胞周期比例，对照组与实验组间差异显著。提示G-Rh2作用24h后，对Hep -2 细胞的周期调控作用主要发生于G 1 期，抑制细胞D N A 合成，滞留于G 1 / S 处，阻止其向S 期发展，进而导致S 期细胞周期比例下降，使细胞生长、增殖受阻。本实验结果与其他学者报道一致。

　　p27kip1是一种肿瘤抑制基因，它能与Cyclin - CDK 等G1期激酶复合物紧密结合，抑制其活性，从而抑制细胞从G 1 期到S 期的转化，在细胞周期运转中起负调控作用。p27kip1还在控制G 0 / G 1 期停滞中起关键作用，在许多G 0 / G 1 期停滞的细胞中都有积聚。免疫组化结果表明G - R h 2 所诱导的p 2 7 蛋白上调表达与G 1 期细胞周期阻滞相吻合。提示G - R h 2 可能通过上调p27 蛋白表达，发挥其细胞周期负调控作用，与特定的细胞周期素依赖性激酶相结合，抑制其活性，使基因组不稳定的恶性细胞在跨越G 1 / S 关卡时受阻，表现为G 1 期细胞周期阻滞，细胞增殖抑制，同时，p27 蛋白在G 0 / G 1 期开始积聚，表现为p27 蛋白表达增强。因此认为G - Rh2 诱导喉癌H e p - 2 细胞p27蛋白表达上调可能是其导致G 1 期细胞周期阻滞的机制之一。