人参皂苷Rh2对荷结肠癌CT-26小鼠抗瘤作用及免疫指标的影响

　　中文摘要

　　目的：研究人参皂苷Rh2对荷瘤小鼠抗肿瘤作用及对免疫指标的影响，寻求抗肿瘤作用强而毒副作用小的中药有效成分。

　　方法：首先进行肿瘤细胞系的培养传代。肿瘤细胞培养至一定数量时，用胰蛋白酶消化重悬，制备成肿瘤细胞悬液，接种于32只健康雌雄各半BALB/c小鼠右侧颈背部皮下，建立荷小鼠结肠癌CT-26动物模型。2周后动物肿瘤模型已稳定，除正常对照组外，将成瘤均匀且肿瘤大小相近的24只荷瘤小鼠模型随机分成3组：0.4%乙醇灌胃对照组、人参皂苷Rh2(0.4%乙醇混悬液)灌胃治疗组、5-FU腹腔注射治疗组。治疗21天后，各组小鼠称重，摘取小鼠眼球，收集血液标本，静置离心后吸取上层血清取样，Elisa(酶联免疫吸附)法测定各组小鼠血清IL-2水平，用酶标仪在450nm波长下测量各小鼠血清的OD(吸光度)值并用应用labsys雷勃酶标仪软件v5.01计算出各孔的IL-2浓度：剥取荷瘤小鼠皮下移植瘤标本，电子天平称重并做好记录，以计算各组荷瘤小鼠抑瘤率。然后取样，用10%福尔马林固定，标本用免疫组织化学染色后，在倒置显微镜下检测各组小鼠皮下移植瘤内CD25+细胞，早期凋亡肿瘤细胞Cleaved.caspase3表达情况;摘取各组小鼠胸腺、脾脏，电子天平称重后，做好记录，以计算各种小鼠胸腺指数及脾指数。

　　结果：

　　1.人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，其抑瘤率为81.76%，5-FU腹腔注射治疗组与酒精灌胃对照组相比，其抑瘤率为91.32%。

　　2.人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞表达Cleaved.caspase3的影响：人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved-caspase3表达率明显增加(P<0.01)，具有显著统计学意义。

　　3.人参皂苷Rh2(0.4%乙醇混悬液)灌胃治疗组与5-FU腹腔注射治疗组相比，小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved.caspase3表达率不及后者(P<0.01)。

　　4.5-FU腹腔注射治疗组同人参皂苷Rh2灌胃组、酒精灌胃对照组相比胸腺指数、脾脏指数、血清IL一2水平均明显降低(P<0.05)。

　　5.人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的免疫器官的影响：在该实验中人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠的胸腺指数、脾脏指数差异无统计学意义(P>0.05)。

　　6.人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的细胞因子的影响：人参皂苷R.h2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠的血清IL-2水平差异无统计学意义(P>0.05)。

　　7.人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠皮下移植瘤内的CD25+细胞的影响：人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠皮下移植瘤内的CD25+细胞浸润无明显增多(P>0.05)。

　　8.小鼠荷瘤以后，胸腺指数、脾脏指数、血清IL-2水平均较正常小鼠降低

　　(P<0.05)，与前人动物实验结果一致。

　　，

　　结论：人参皂苷Rh2 0.4mg/kg(0.4%乙醇混悬液)经口服能够显著抑制小鼠结肠癌CT-26肿瘤细胞生长，增加小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved-caspase3阳性表达率，促进小鼠结肠癌CT-26肿瘤细胞凋亡，但作用不及5-FU。从毒副作用方面来说，人参皂苷Rh20.4mg/kg经口服在发挥抗肿瘤作用的同时没有抑制荷瘤小鼠免疫功能。但对提高荷小鼠结肠癌CT-26小鼠胸腺指数、脾指数血清IL-2水平，肿瘤局部CD25+细胞阳性表达率也无明显作用。

　　关键词：人参皂苷Rh2结肠癌CT26细胞凋亡免疫功能血清IL-2

　　前言

　　研究现状、成果

　　近年来的研究发现，我国的名贵中药人参的活性成分中的人参皂苷(ginsenoside，GS)Rh2具有抗癌活性，能诱导细胞凋亡和分化而发挥抗肿瘤作用。国内外一些学者先后报道人参皂苷Rh2对多种肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞SK.HEP.1等具有抑制增殖和诱导凋亡作用。此外人参皂苷Rh2对小鼠B16-BL6黑色素瘤细胞高转移株自发性肺部转移具有显著的抑制作用，可提高柔红霉素、长春新碱等抗肿瘤药物对多耐药白血病细胞的细胞毒性，人参皂苷Rh2注射液能提高荷肝癌(H22)小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、促进该小鼠血清中羊红血球抗体生成。虽然对人参皂苷Rh2的抗肿瘤作用已有多方面研究，但本领域还应该进行系统和深入的研究。

　　研究目的、方法

　　研究目的：研究人参皂苷Rh2对荷瘤小鼠抗肿瘤作用及对免疫指标的影响，寻求抗肿瘤作用强而毒副作用小的中药有效成分。

　　研究方法：迄今为止，动物移植性肿瘤实验方法，仍是研究治疗抗肿瘤作用最通用的方法之一。治疗对移植性肿瘤生长抑制率，荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数的影响，是评价肿瘤治疗疗效的较为重要的指标。该实验首先进行肿瘤细胞系的培养传代。肿瘤细胞培养至一定数量时，用胰蛋白酶消化重悬，制备成肿瘤细胞悬液，接种于32只健康雌雄各半BALB/c小鼠右侧颈背部皮下，建立荷小鼠结肠癌CT-26动物模型。2周后动物肿瘤模型己稳定，除正常对照组外，将成瘤均匀且肿瘤大小相近的24只荷瘤小鼠模型随机分成3组：0.4%乙醇灌胃对照组、人参皂苷Rh2灌胃治疗组、5-FU腹腔注射治疗组。治疗21天后，各组小鼠称重，摘

　　取小鼠眼球，收集血液标本，Elisa(酶联免疫吸附)法测定各组小鼠血清IL-2水平;剥取荷瘤小鼠皮下移植瘤标本，电子天平称重并做好记录，以计算各组荷瘤小鼠抑瘤率。然后取样，用10%福尔马林固定，标本用免疫组织化学染色后，在倒置显微镜下检测各组小鼠皮下移植瘤P勺CD25+细胞，早期凋亡肿瘤细胞Cleaved-caspase3表达情况;摘取各组小鼠胸腺、脾脏，电子天平称重后，做好记录，以计算各种小鼠脾指数及胸腺指数。

　　对象与方法

　　1.实验材料

　　1.1肿瘤细胞系小鼠结肠癌CT-26细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

　　1.2小鼠动物健康亚洲近交系BALB/c小鼠40只，清洁级，鼠龄5.6周龄，体重18-209，雌雄各半。购于天津市放射医学研究所。在标准环境下饲养用于实验。

　　1.3鼠笼、饲料、垫料、水：天津市南开医院中西医结合研究所实验动物中心。

　　1.4人参皂苷Rh2标准品(纯度>98%)，购于天津市药典标准仪器药品开发公司。

　　1.5主要试剂

　　a.RPMI-1640细胞培养液：北京天润善达生物制剂有限责任公司

　　b.胎牛血清(已灭活)：MDgenics

　　c.无菌25cm2，75cm2细胞培养瓶：Coming公司

　　d.0.25%胰蛋白酶：北京天润善达生物制剂有限责任公司

　　e.PBS：天津润泰科技发展有限公司

　　f . 0.9%生理盐水：Baxter，中国百特公司

　　g.二甲基亚砜(DMSO)：德国AppliChem公司

　　h.5-FU注射液购于阿法埃莎(天津)化学有限公司

　　i.小鼠血清IL-2酶联免疫(Elisa)检测试剂盒：R&D公司。

　　j.免疫组化一抗：兔抗小鼠CD25+细胞免疫组化染色试剂盒：HistostainTM.PlusKitSP.0023;DAB染色试剂盒：均购于北京博奥森生物技术有限责任公司。

　　k.免疫组化一抗：兔抗小鼠Cleaved.caspase3，CST，购于北京友谊中联科技有限责任公司。

　　L.APES(3-氨丙基-3.乙氧基甲硅烷)：北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.6 主要耗材

　　a.无菌棉球：天津市振宇卫生材料厂;无菌手套：桂林乳胶厂高邦牌中号;一次性无菌帽子口罩：新乡市长东医疗器械有限公司;无菌纱布：新乡市大方医疗器械制造有限公司;无菌手术衣

　　b.酒精、酒精灯;玻璃吸管，不锈钢吸管桶，胶塞，饭盒，0.9%生理盐水500ml玻璃输液瓶。

　　c.1.5ml冻存管：CRYO.sTM，EP管、移液管：碧云天生物实验耗材、lml无菌注射器：美国BD公司，2.5ml、5ml、10ml、20ml无菌注射器：浙江京环医疗用品有限责任公司;针式滤帽、10ml、50ml离心管：JETBio.filtration。

　　1.7主要仪器与设备

　　a.超净工作台：上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司，型号：SW-CJ-2

　　b.恒温CO2培养箱：Thermo，型号：371

　　c.倒置显微镜：Leiea，型号：DMIIL

　　d.-80℃超低温冰箱：FormaScientific，型号：RevcoULT-1786-6V普通冰箱：美凌，型号：BCD-183D

　　e.冻存细胞专用液氮罐及液氮：乐山市东亚机电工贸有限公司，型号：YDS-30B

　　f 离心机：Sigma，型号：3k30

　　g.电子精密天平：SARTORIOSAG型号：BP211D

　　h.普通天平：北京大栅栏天平厂东方红牌架盘天平

　　i.电热恒温干燥箱：天津市实验仪器厂，型号：201

　　j.高压蒸汽消毒锅：山东新华医疗器械股份有限公司

　　k.超纯水机：Barnstead，型号：D8611

　　1.电热恒温水浴箱：上海医疗器械七厂，型号：HH-W21-Cu600

　　m.移液器(5-50μl;20-200Jμl;100-1000μl)：Thermo

　　n.数码相机：Nikon coolpix4500

　　o.无水乙醇：天津市方得科技有限公司，分析纯

　　p.湿温度表：天津市津南区工艺美术陶瓷厂，型号：GJWS-A3

　　q.病理切片机：Leica RM2255，德国

　　r.石蜡包埋机：Leica EGl 150H，德国

　　s.微波炉：Galanz，广东

　　2.实验方法

　　2.1肿瘤细胞系的培养、传代、冻存及复苏。

　　2.1.1实验开始前的准备工作：

　　(1)0.9%生理盐水500ml玻璃输液瓶的消毒

　　a、刷洗、烘干：将使用过的0.9%生理盐水500ml玻璃输液瓶用自来水冲洗3次，然后置于电烤箱2000C30分钟烘干。

　　b、泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液(重铬酸钾120g.浓硫酸200ml：蒸馏水1000m1)，12小时后从酸缸内捞出，立即用自来水冲洗10次，再用蒸馏水冲洗3次。

　　c、烘干、包装：冲洗干净的玻璃器皿烘干后取出盖上消毒完毕的橡胶瓶塞，再用无菌纱布包住瓶塞，用耐高温包装绳将无菌纱布系紧于瓶口。最后将7号针头插入瓶塞，以便于高温消毒时平衡瓶内外气压。

　　d、高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出1分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持30分钟即可。消毒完毕后，待气压表指数为0时，立即打开高压锅，将瓶塞上的7号针头拔出，75%酒精消毒玻璃瓶表面，置于超净工作台，开启超净工作台内的紫外线灯照射30分钟。

　　(2)玻璃吸管、玻璃漏斗的清洗消毒：

　　刚用过的玻璃吸管立即用自来水冲洗3次，以避免细胞培养液中的蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗。玻璃吸管、玻璃漏斗清洗后空干，泡酸清洗步骤同0.9%生理盐水500ml玻璃输液瓶。经泡酸清洗后的吸管、漏斗放于洁净的托盘后放入电烤箱中200℃30分钟烘干。烘干后的吸管尾端塞入无菌棉球，松紧要适中，放入吸管筒中，之前吸管筒底部要垫数层无菌纱布，要完全覆盖吸管筒底部，以保护吸管头。确定吸管筒盖上的排气孔与吸管筒身上的排气孔相对后，将吸管筒放入高压蒸汽消毒锅内;漏斗则要放入底部铺好数层无菌医用纱布的铝制饭盒中，盖好饭盒盖，用消毒巾包裹饭盒后再放入高压蒸汽消毒锅内。高压蒸汽消毒操作步骤同上，完毕后将吸管筒盖上的排气孔与吸管筒身上的排气孔错开，放入超净工作台后，开启超净工作台内的紫外线照射30分钟。

　　(3)细胞培养液的配制(10%胎牛血清RPMI.1640细胞培养液)

　　进入细胞培养室内操作前先开启室内及超净工作台内的紫外灯照射30分钟进行室内及超净工作台内的消毒，紫外线消毒后，换好拖鞋，75%医用酒精消毒双手，戴好无菌帽，无菌口罩，穿好无菌衣，戴好无菌手套。超净工作台内用75%医用酒精棉球擦拭消毒后，将所用物品包括RPMI-1640细胞培养液，胎牛血清，无菌20ml一次性注射器，用75%医用酒精完全擦拭各自外包装后放入超净工作台内。开启超净工作台内的鼓风机，点燃酒精灯，3分钟后，开始操作。各种瓶盖，瓶塞，在开启盖紧前瓶要过火消毒，盖紧瓶盖，瓶塞时，瓶口也要过火消毒。用无菌20ml一次性注射器抽吸50ml胎牛血清，注入已消毒的0.9%生理盐水500ml玻璃输液瓶内，注意操作时，针头勿碰瓶口。在将已消毒的玻璃漏斗放置瓶口，倒入RPMI-1640细胞培养液，直至液面到达瓶身500ml标记处。操作完毕后，开启超净工作台的紫外灯照射30分钟消毒。

　　2.1.2 肿瘤细胞系的培养及传代

　　2.1.2.1 肿瘤细胞系的培养

　　细胞培养室及超净工作台事先做好紫外线消毒，从外地购买的细胞邮寄到实验室后，换好拖鞋，75%医用酒精消毒双手，戴好无菌帽，无菌口罩，穿好无菌衣，戴好无菌手套，小心打开包装盒，逐层去掉包裹细胞培养液的消毒棉。75%医用酒精消毒无菌手套、细胞培养瓶、倒置显微镜的载物台。消毒完毕后将细胞培养瓶细胞附着面朝上放于倒置显微镜的载物台上，观察细胞状态。细胞贴壁牢固表明细胞状态较好。此时开始细胞换液操作，用75%医用酒精棉球消毒超净工作台，同样方法消毒细胞培养瓶及含事先配制好的细胞培养液的输液瓶后放入超净工作台内。超净工作台内的操作顺序及注意事项同上。25crn2培养瓶每次换 液10ml。完成细胞换液操作后，75%医用酒精棉球消毒细胞培养瓶，打开C02培 养箱，稍旋松细胞培养瓶盖，放入5%C02恒温370C培养箱进行培养。因肿瘤细 胞生长分裂较快，所以要及时观察细胞营养、生长状况。如细胞培养液变成黄 色，提示营养成分大部分已被消耗，营养液内细胞代谢毒性产物堆积，此时要 及时给细胞换液。

　　2.1.2.2细胞的传代操作(胰蛋白酶消化法)

　　(1)传代前准备：

　　a、细胞培养室及超净工作台事先做好紫外线消毒。进入细胞培养室穿戴、着装 操作同前。

　　b、用75%酒精擦拭超净工作台和双手。

　　C、把己消毒的空培养瓶、已配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子用 75%酒精擦拭后放入超净工作台内。正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

　　d、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

　　e、从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜 的台面，再在镜下观察细胞。细胞贴壁生长分裂，覆盖25cm2细胞培养瓶底面积80%左右时开始传代，按1：2比例传代。

　　(2)胰蛋白酶消化;

　　a、已消毒的空培养瓶、已配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子烧口消毒后，打开瓶盖。倒掉细胞培养瓶内的培养液，结束时注意要用事先准备好的酒精棉球吸去瓶口附着的培养液，以防瓶口容易污染。

　　b、用无菌10ml注射器抽吸PBS溶液5ml注入细胞培养瓶，注意此时培养瓶细胞附着面向上。注入PBS溶液后翻转细胞培养瓶，轻轻摇动洗涤细胞。洗涤后倒掉细胞培养瓶内得PBS溶液，操作及注意事项同前。细胞重复洗涤2次。

　　C、加入消化液：用无菌2.5ml注射器抽吸胰蛋白酶液0.5ml，以覆盖住所有细胞。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，或有成片浮起的迹象就要立即倒掉胰蛋白酶并向培养瓶内加入培养液3ml以终止消化。

　　d、吹打分散细胞：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

　　e、分装稀释细胞：将细胞悬液吸出分装至2个培养瓶中，每个培养瓶加入10ml培养基，瓶盖瓶口过火消毒后旋紧瓶盖。

　　f、继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入C02培养箱中继续培养。

　　2.1.3肿瘤细胞系的冻存及复苏：

　　为防止肿瘤细胞系在培养过程中被污染，导致细胞源丧失，待细胞生长繁殖至一定数量后，及时进行肿瘤细胞系的冻存及复苏，复苏是为了检查冻存操作是否成功。该实验于肿瘤细胞第一次传代后，当细胞贴壁生长分裂覆盖25crn2细胞培养瓶底面积80%后开始肿瘤细胞系的冻存操作。

　　2.1.3.1细胞的冻存操作(以下各步操作前细胞培养室及超净工作台消毒，准备所需物品的步骤同前。)

　　(1)将选定的要冻存的细胞于前一天换液，该实验选定细胞质透亮，生长旺盛，贴壁生长分裂覆盖25cm2细胞培养瓶底面积约60%时的细胞，过夜后细胞就能覆盖培养瓶底面积的80%。

　　(2)配制细胞冻存液

　　首先用针式滤帽过滤二甲基亚砜(DMSO)除菌消毒，DMSO，灭活胎牛血清，RPMI.1640细胞培养液按1：2：7比例配制10ml，在超净工作台内严格无菌操作。

　　(3)从CO2培养箱中取出细胞，细胞培养瓶旋紧瓶盖后用75%酒精消毒外表面，在超净工作台内弃掉培养液，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，吹打分散细胞等各步操作同前。

　　(4)细胞计数：

　　a、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

　　b、制备计数用的细胞悬液：用吸管将细胞吹打均匀后，吸取5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液(0.4%)，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

　　c、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量加入0.4%台盼蓝染液的细胞悬液，沿盖玻片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖玻片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

　　d、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。

　　e、计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度：

　　(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)x2x10的4次方

　　说明：公式推导见附录。

　　细胞计数要点：

　　①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10的4次方个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;

　　②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

　　③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确;

　　④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。该实验经过计算当细胞贴壁生长分裂覆盖25cm2细胞培养瓶底面积80%左右时，每瓶约含4×106个细胞。

　　(5)离心及分装

　　收集细胞悬液于离心管中，离心管口及管盖过火消毒后，旋紧管盖，用封口膜封紧。配平后将离心机调整为转速1000转每分，时间5分钟。离心后可见细胞沉积在离心管底部。用酒精棉球消毒双手及离心管后，在超净工作台内进一步操作。揭去封口膜后，镊子、离心管口过火消毒，用镊子旋开离心管盖，倒掉细胞培养液，结束时注意要用酒精棉球吸去离心管口附着的培养液，以防污染。用5ml无菌注射器按每个细胞培养瓶lml比例抽吸细胞冻存液，缓慢注入离心管中，用玻璃吸管小心吹打成细胞悬液，分装于1.5ml冻存管中，每管lml。旋紧冻存管盖后，在其外壁，写明细胞种类，冻存日期。

　　(6)慢速逐步冷冻

　　冻存管分装后按下列顺序降温：4"C冰箱保险室(20分钟)一冰箱冷冻室(30分钟)_超低温冰箱(-80"C过夜)_液氮(-196℃长期)。操作时应小心，冻存管在未放入超低温冰箱前，勿使之倾倒，以防复苏时易污染。避免液氮冻伤。液氮定期检查，如发现液氮挥发一半时要及时补充。

　　2.1.3.2肿瘤细胞系的复苏：

　　细胞复苏的原则一快速融化：必须将冻存在.196"C液氮中的细胞快速融化至37℃，一般不超过1分钟。使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶，对细胞造成损害。

　　具体操作

　　(1)实验前准备

　　a、准备一个洁净的1000ml的烧杯，内装2/3杯37℃的温水。

　　b、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

　　c、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的吸管、培养瓶等等。

　　(2)取出冻存管：

　　a、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

　　b、从液氮罐中取出所需细胞，同时核对管外的编号。

　　(3)迅速解冻：

　　a、迅速将冻存管投入到装有37℃温水的1000ml烧杯中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

　　b、约lmin后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再放入超净台内。

　　(4)培养细胞

　　将细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃、5%C02的培养箱p勺24tJ‘,时后观察细胞贴壁情况，贴壁细胞较多提示复苏成功，换液继续培养箱培养。

　　2.2荷瘤小鼠模型的建立及分组

　　2.2.1荷瘤小鼠模型的建立

　　(1)移植肿瘤前动物的选择

　　将检疫合格的BALB/ct]‘,鼠购回后在饲养室内适应5天。随机选择发育良好，体躯伸长，肌肉丰满，毛色光亮润泽，被毛紧贴身躯，眼睛明亮，活泼且善于跳跃的小鼠32只雌雄各半进行接种。

　　(2)移植肿瘤前细胞的准备

　　将选定的用于接种的细胞于前一天换液，该实验选定细胞质透亮，生长旺盛，处于对数生长期，贴壁生长分裂覆盖75cm2细胞培养瓶底面积约60%时的细胞。过夜后细胞可生长覆盖75cm2细胞培养瓶底面积约80%，经过计数，此时每瓶约含1.2x1017个活细胞。在超净工作台内弃掉培养液，洗涤细胞后，每个75cm2细胞培养瓶内加入lml胰蛋白酶，轻轻摇晃使之覆盖所有细胞，细胞间连接较疏松时，倒掉胰蛋白酶，每个75cm2细胞培养瓶内加入3ml细胞培养液，终止消化。用玻璃吸管轻轻吹打分散细胞后，收集到己消过毒的离心管中，进行离心，1000转每分，时间5分钟。用无菌0.9%生理盐水调整细胞悬液浓度为l×106个/0.2ml，无菌玻璃吸管吹打均匀后，用无菌lml注射器抽吸肿瘤细胞悬液，每只注射器抽吸0.8ml，套好针帽，准备接种。

　　(3)皮下移植瘤的接种

　　事先做好小鼠饲养室的消毒。将已抽吸肿瘤细胞悬液的无菌lml注射器，暂放于普通冰箱40℃保鲜室内，随用随取，以保证细胞活力。接种过程力求迅速，从开始处理细胞到最后1只小鼠接种完毕，控制在60分钟内。从鼠笼中每次抓取1只小鼠，用手捏住小鼠尾巴后端，提起小鼠放于鼠笼金属罩上，小鼠出于本能，会向前抓持，此时用左手拇指与食指抓住小鼠颈背部皮肤，再用左手无名指与小指夹住尾巴，固定小鼠。接种过程必须严格无菌操作，在已消毒的超净工作台内进行，固定小鼠后，用酒精棉球消毒预接种部位皮肤，右手持针，与皮肤约呈20度角刺破皮肤，此时会有明显突破感。之后适当减小角度，沿皮下向前进针，刺入约lcm时，轻轻晃动针头，如阻力较小，则针头位于小鼠皮下，此时注入肿瘤细胞悬液。如阻力较大，则针头或刺入肌肉或刺入皮内，须退针调整进针方向，使针头位于小鼠皮下。每只小鼠右颈背部皮下接种0.2ml。注入细胞悬液后保持1.2秒再退针，退针后用镊子夹闭针眼，防止细胞悬液流出。用细胞悬液接种肿瘤时，因瘤液细胞浓度较高，细胞容易沉积，造成细胞分布不均。种瘤时，一定要常用手指轻敲、上下颠倒装有瘤液的lml注射器几次，混匀细胞。操作要避免过于剧烈，以免造成细胞损伤。此外，接种手法(进针深浅)也要一致，因为这两种情况都会导致接种的皮下移植瘤大小不一，而影响实验数据的准确性。

　　(4)接种肿瘤后对动物的护理：

　　a、实验室每天清扫1次，每隔2天用来苏消毒拖地，紫外照射45分钟;保持实验室清洁整齐，创造良好的动物饲养环境;离开实验室时，注意水电门窗是关闭。

　　b、控制动物饲养室的温度18~24℃，湿度40%.60%。勤换小鼠底料，勤洗水瓶，保持鼠笼垫料的清洁，饮水的清洁，饲料的营养充分。

　　C、每天观察动物有无异常反应，水瓶是否漏水;

　　2.2.2荷瘤小鼠模型的建立及分组

　　从小鼠皮下接种肿瘤之日算起，2周后模型比较稳定。除正常对照组8只小鼠外(雌雄各半)，选取皮下移植瘤大小比较一致的BABL/c小鼠24只，雌雄各半，按完全随机表进行科学分组，分为0.4%乙醇灌胃对照组，5-FU腹腔注射组，人参皂苷Rh2灌胃组，每组8只，雌雄各半，4组小鼠置于8个鼠笼中分开饲养。用苦味酸水溶液给小鼠标号，无染色为1号，右后肢染色为2号，左后肢染色为3号，左前肢染色为4号，要清楚无重复。

　　2.3各组小鼠所用药物的配制

　　(1)0.4%乙醇的配N-用20~200μl移液器吸取无水乙醇160μl于无菌50ml离心管中，再加医用注射用水至离心管身40ml刻度水平，盖好离心管盖，摇晃均匀，置于冰箱40C保鲜室保存。

　　(2)0.625mg/ml 5-FU的配制：无菌袋装0.9%氯化钠溶液袋口用75%医用酒精棉球消毒后，用无菌10ml注射器将抽吸掉22ml，再用5ml无菌注射器抽吸250mg/10ml5-FU 2ml，注入前述袋装0.9%氯化钠溶液中，摇晃均匀，置于冰箱40C保鲜室保存。

　　(3)人参皂苷Rh2 0.4%乙醇混悬液的配制：用电子天平秤取3.2mg人参皂苷Rh2，倒入无菌50ml离心管中，再用2-200μ1移液器吸取无水乙醇160μl，逐滴加入离心管中，边加边震荡，以使人参皂苷Rh2完全溶解，最后加医用注射用水至离心管身40ml刻度水平，盖好离心管盖，摇晃均匀，所得溶液为混悬液，每次给小鼠给药前必须将其摇晃混匀。置于冰箱40C保鲜室保存。

　　注意：整个配药过程注意无菌操作。

　　2.4各组小鼠给药方法

　　(1)0.4%乙醇灌胃对照组：用lml无菌注射器拔掉针头，换上小鼠灌胃针。抽吸0.4%乙醇0.8ml，准备灌胃。用左手拇指和食指抓住小鼠头颈部皮肤，无名指和小指夹住鼠尾，将鼠抓持在手掌内，使小鼠腹部向上，头部向上有一定的倾斜角度，固定好小鼠。固定小鼠时不要抓得太紧，以免颈部皮肤向后拉，勒住食管，灌胃针不易插入，或容易损伤食管。也不能抓得太松，否则鼠容易挣脱咬伤操作者的手指，鼠一旦挣脱，再次抓取时将会十分困难。灌胃时，右手持灌胃针，使灌胃针头沿着鼠右侧嘴角插入口腔，然后用灌胃针头向后上方压迫小鼠头部，使口腔与食道呈一直线，再将灌胃针头沿上颚壁轻轻推入食道，当针头行进2.3cm时，可稍感有抵抗，是小鼠食管通过膈肌部，此时若动物呼吸无异常，表示针头已进入胃内，即可灌入药液。若进针阻力较大，小鼠呼吸异常或强烈挣扎，表示针头未进入胃内，不能强行进针，否则会捅破食管，甚至注入肺内造成动物死亡。要立即拔出针头，按上述方法重新操作。小鼠灌胃剂量按0.02ml/g标准执行，每天一次，共2l天。

　　(2)5-FU腹腔注射组：用lml无菌注射器抽吸0.625mg/ml5-FU注射液0.8ml，准备腹腔注射。用左手如前操作固定好小鼠，使小鼠呈头低位，腹部朝上，用75%酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，右手持注射器与腹部皮肤呈45度角，从下腹部朝头的方向刺入腹腔，轻轻推注药液。针头刺入部位不宜太接近上腹部或太深，以免刺破内脏。小鼠腹腔注射剂量按12.5mg/Kg标准执行，每三天一次，共21天。

　　(3)人参皂苷Rh2灌胃组：将人参皂苷Rh2O.4%乙醇混悬液摇匀后，用1ml无菌注射器抽吸0.8ml，换上灌胃针头，准备灌胃。固定小鼠操作，灌胃注意事项同前。小鼠灌胃剂量按0.4mg/l(g标准执行，每天一次，共21天。每次灌胃后，灌胃针头用自来水冲洗干净，以准备下次使用。各组荷瘤BABL/c小,鼠每4天称重1次，做好记录，给药时按最新体重执行;每天按指定时间上午9点给药，药物剂量、给药方式与组别一一对应，经核对无误后给药;腹腔注射前用75%医用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，1个棉球消毒5个小鼠，5个小鼠用1个注射器;注射或灌胃给药时务必注意小鼠外逃或窜组。

　　(4)正常对照组小鼠正常饮食、进水。

　　2.5采集标本

　　各组小鼠经过为期21天的处理后，开始收集标本并处死小鼠。处理小鼠前先称好重量，并做好记录，并将收集标本所用的医用无菌促凝管，装有4℃ 0.9%生理盐水50ml无菌试管，装皮下移植瘤标本用的青霉素瓶标好组别与号码。用左手固定好小鼠后，采用摘取眼球放血方法收集小鼠血液，收集血液标本后若小鼠依然存活再用脱颈方法处死。处死小鼠后，用眼科剪眼科镊配合使用，小心剥取皮下移植瘤。刚剥下来的肿瘤用无菌干棉球吸净表面的血迹，用5×5cm大小的硫酸纸垫于电子天平载物台，称重调零后将准备好的肿瘤用电子天平称重，做好记录，用眼科剪从每块皮下移植瘤上取约0.5cmx0.5cm大小的标本(所取标本包括包膜)，一一对应放入装有10%福尔马林的青霉素瓶中固定。从剥取第一个小鼠皮下移植瘤开始至最后一个取材标本被固定时间一定要快，以免肿瘤组织离体时间太长而坏死，影响检测指标。该实验每组用时25分钟。放好标尺，将已取材的皮下移植瘤按各实验组从d,N大依次排列，摄像留取各组瘤体对比资料。

　　各组小鼠血液标本收集于医用无菌促凝管中静置30分钟后，可见血液标本明显分层，上层是淡黄色透亮液体，下层是不规则的血凝块。此时开始分批离心，每次8管，天平配平后，开始离心，3500转/分，离心10分钟。离心后，用一次性塑料吸管小心吸取上层淡黄色透亮液体，滴入1.5mlEP管中，每管0.5ml，每个血液标本单独使用1个塑料吸管，单独使用1个EP管。盖好EP管盖，标记好组别，雌雄，标号。放入冻存管盒中，再置于.800C超低温冰箱中，冷冻保存，以各检测。

　　2.6小鼠血清IL.2的检测

　　R&D公司小鼠白细胞介素-2(IL-2)酶联免疫检测试剂盒工作原理：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(EUSA)测定样品中小鼠白介素-2(IL-2)的水平。向预先包被了小白鼠IL-2单克隆抗体的酶标孔中加入含小鼠IL-2的样品，温浴;洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记过的IL-2抗体。再经过温浴和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A，B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠IL-2的浓度呈正相关。

　　(1)实验开始前的准备

　　分别从-80℃超低温冰箱，4℃冰箱中取出小鼠血清样品，小鼠白细胞介素-2(IL-2)酶联免疫检测试剂盒。在开启试剂盒之前室温平衡30分钟。在此期间，准备好所需物品与仪器设备。包括开启37℃恒温水浴箱，超纯水机，用蒸馏水冲洗1000ml容量瓶，200ml量筒，装稀释好洗涤液的水槽，备好移液器及一次性吸头，EP管，EP管要1.5标号，吸水纸。

　　(2)稀释洗涤液

　　试剂盒室温平衡30分钟后，开启试剂盒，将20ml20倍浓缩洗涤液倒入冲洗干净的1000ml容量瓶中，再用量筒量取380ml蒸馏水倒入容量瓶中，轻轻摇匀。

　　(3)标准品的倍比稀释

　　标准品浓度为640ng/L，首先用移液器从装有标准品的试剂瓶中吸取120ul的原倍标准品，放入标号为5的洁净空EP管中，换好移液器吸头从装有标准品稀释液的试剂瓶中吸取120μl稀释液，加入同--EP管中，并用移液器轻轻吹打均匀。吹打混匀后，用移液器抽吸120μl，注入标号为4的洁净空EP管中，换好移液器吸头后，从装有标准品稀释液的试剂瓶中吸取120pl稀释液，加入同标号为4的EP管中，用移液器轻轻吹打混匀后，抽吸120pl注入标号为3的洁净空EP管中，以下步骤以此类推，直至标号为1的EP管中的标准品稀释液混匀。最终标号1.5的EP管中的标准品浓度依次为20ng/L，40ng/L，80ng/L，160ng/L，320ng/L，其外观为黄，颜色依次加深。

　　(4)酶标孔中加入标准品与待测血清样品

　　48孔酶标板上分别设空白孔，标准品孔，待测样品孔。其中空白孔不加小鼠血清样品与酶标试剂，其余各步操作同其他孔。按浓度由低到高顺序，向酶标包被板上的5个标准品孔中依次加入上述浓度的标准品，每孔只加一种浓度的标准品，各50μl。向酶标包被板上的待测样品孔中先加样品稀释液，各40μl，然后再分别加入待测小鼠血清样品，每孔只加入一只小鼠的血清样品，各10μl。轻轻晃动均匀，用封板膜盖好酶标板，于37℃恒温水浴箱内温浴30分钟。

　　(5)酶标板的第一次洗涤

　　经37℃恒温水浴箱内温浴30分钟后，取出酶标板，甩掉液体，每孔加入0.35ml稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，在实验台上铺垫数层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次。如此洗涤、拍干重复5次。

　　(6)加入酶标试剂

　　除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶标试剂50μl，轻轻晃动均匀，用封板膜盖好酶标板，于37℃恒温水浴箱内温浴30分钟。

　　(7)酶标板的第二次洗涤

　　时间到后，取出酶标板，进行第二次洗涤，方法步骤同第一次洗涤。

　　(8)加入显色剂

　　每孔先加入显示剂A50μI，再加入显色剂B501xl，显色剂B对光敏感，要避免长时间暴露于光下。轻轻振荡均匀，37℃恒温水浴箱内避光显色10分钟。

　　(9)终止反应

　　时间到后，取出酶标板，每孔加入终止液50μl，终止反应，此时液体的颜色由蓝色立即变成黄色。

　　(10)用酶标仪测定各孔的吸光度值(OD值)

　　在加入终止液的15分钟以内进行。测定时，在计算机界面上以空白孔调零，对应加入倍比稀释的标准品孔的空格内输入相应的浓度值，在450nm波长下测量，应用labsys雷勃酶标仪软件v5.01计算出各孔的IL-2浓度。计算各个小鼠血清LI-2浓度时，各孔的测定值要乘以总稀释倍数，该实验各孔的测定值乘以5。

　　2.7小鼠皮下移植瘤标本的HE染色

　　2.7.1病理切片的准备

　　经10%中性甲醛固定的小鼠皮下移植瘤，依次经过70%酒精3小时、80%酒精34,时、90%酒精3小时、95%酒精过夜、无水酒精1.5小时两次，脱水，松节油透明两次，每次20分钟，再浸蜡3小时，将选择好要观看的组织面朝下，石蜡包埋，包埋动作要快，否则石蜡稍凝固后再放标本的话做出的片子周围气泡较多，标本制成蜡块后放于病理切片机上，进行连续5pm切片。选择的病理切片先在无水乙醇中浸一下(借助无水乙醇的表面张力有利于展片)，再放入恒温水箱中展片，水温不宜过高，一般50℃。同时注意展片手法，展片成功后，用事先准备好的载玻片捞片，并做好标记，一个片子上有1层组织就可以了，不宜过多，以免影响片子质量。捞出的病理切片置于病理烤片机内烤干温度设置为60度，烤干后放于病理切片盒内，以备HE染色及免疫组织化学染色之用。

　　2.7.2染色程序

　　(1)HE染液的配制：

　　a、Harris苏木素染液的配制：称取苏木素精1g，一氧化汞0.5g，硫酸铝钾20g，量取无水乙醇10ml，蒸馏水200ml。苏木素溶于无水乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，二者混合后煮沸，离火，加入一氧化汞，用玻棒搅拌，试剂变为深紫色，立即移入冷水快速冷却，静置一夜，过滤，棕色小磨口试剂瓶密封保存。使用前加入5%冰乙酸4ml(或冰乙酸3滴)。

　　b、0.5%伊红(水溶性)：称取伊红0.5g，量取95%乙醇25ml，蒸馏水75ml。先取少量蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红碾碎并搅溶，再加入全部蒸馏水，完全溶解后，再加入乙醇，最后加入冰乙酸1滴。白色小磨口试剂瓶密封保存。

　　C、1%盐酸水溶液：量取盐酸3ml，蒸馏水297ml。混匀，白色试剂瓶保存。

　　d、中性树胶封片剂：向125ml棕色滴瓶中倒入中性树胶若干，加入二甲苯适量用吸管调匀，有一定粘稠度即可。

　　(2)染色步骤

　　准备好试剂二甲苯1瓶，Harris苏木素染液，无水乙醇2瓶，1%盐酸水溶液，95%乙醇2瓶，0.5%伊红(水溶性)染液，中性树胶封片剂。

　　a、 电吹风吹片或烤片，至溶蜡;

　　b、入二甲苯(I)中脱蜡5分钟，用吸水纸吸干液体;

　　C、入二甲苯(II)中脱蜡10分钟(切片透明)，用吸水纸吸干

　　d、入100%乙醇(I)5分钟，用吸水纸吸干液体：

　　e、入100%乙醇(II)5分钟，用吸水纸吸干液体;

　　f、入95%乙醇3分钟;

　　g、入流水2分钟，用吸水纸吸干水分;

　　h、Harris苏木素染色4~8分钟;

　　i、自来水稍洗; .

　　J、1%盐酸水溶液分化5～10秒(切片由蓝变红);

　　k、自来水洗返蓝15～30分钟;

　　l、0.5%伊红(水溶性)染色30秒～1分

　　m、95%乙醇(I)脱水5分钟，用吸水纸吸干液体;

　　n、95%乙醇(II)5分钟，用吸水纸吸干液体;

　　O、入100%乙醇(I)5分钟，用吸水纸吸干液体;

　　P、入100%乙醇(II)2分钟，用吸水纸吸干液体：

　　q、入二甲苯(I)中透明2～3分钟，用吸水纸吸干液体;

　　r、入二甲苯(II)中透明5分钟;

　　S、中性树胶封片。

　　t、镜下观察结果：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。

　　(3)注意事项

　　a、苏木素染色时间应根据染液的新鲜或陈旧、及着色力决定。

　　b、盐酸分化要恰当，分化不足，会核、浆共染，分化过度会造成核染色过浅。

　　C、水洗蓝化时间应充分，以防褪色。

　　d、封片后，玻片应及时贴上标签并写上编号。

　　2.8小鼠皮下移植瘤标本的免疫组织化学染色

　　2.8.1、载玻片的处理：

　　用APES(3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)处理载玻片以防脱片。工作液现用现配。将洁净的载玻片放入按1:50比例APES与丙酮配制的工作液中，停留20-30秒钟，取出稍停片刻，再入蒸馏水中洗去未结合的APES，置病理切片盒中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

　　2.8.2病理切片的准备操作步骤同前

　　2.8.3免疫组织化学染色步骤

　　(1)将准备好的病理切片置于烤箱过夜(温度稍高于蜡的熔点几度即可，不要太高，该实验为600C)

　　(2)脱蜡：将烤好的病理切片放入二甲苯中浸泡三次，每次5分钟。

　　(3)再将切片依次放入100%酒精，100%酒精，95%酒精，85%酒精中浸泡，各5分钟。

　　(4)将病理切片用蒸馏水冲洗5分钟。

　　(5)向病理切片滴加3%H202去离子水，要覆盖整个标本，室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

　　(6)PBS冲洗两次，每次2分钟

　　(7)微波法抗原热修复：将切片放入盛有抗原修复液(枸橼酸盐缓冲液0.01M，PH6.0)的容器内，微波炉中依下列步骤操作：96℃加热5分钟一停10分钟一加热5分钟一停5分钟一加热5分钟，以便使蛋白质能够恢复原有的空间构型。

　　(8)冷却至室温(切片仍浸于修复液之中)

　　(9)PBS冲洗两次，每次5分钟

　　(10)滴加正常山羊血清工作液(试剂A)，封盖标本，室温孵育15分钟(在保湿盒里)

　　(11)甩去血清，不用洗涤。

　　(12)滴加用PBS适当比例稀释的一抗(CD25+细胞抗体的稀释度均为l：300，Cleaved.caspase3蛋白抗体稀释度为1：200)，覆盖到整个标本，加之前用洗耳球将标本上的水吹干净。加之前还可用蜡将标本圈上，这样较容易加样，而且不浪费抗体。预实验时探索一抗浓度相当重要，这是决定染色成败的关键步骤之一，要想阳性细胞与背景对比明显则使用较低浓度孵育较长时间，一般是病理切片放于湿盒中4。C过夜或是37℃2.3tJ,时。该实验使用的是第一种方法。

　　(13)PBS冲洗三次，每次3分钟

　　(14)滴加二抗(生物素标记山羊抗兔IgG，试NB)，室温孵育20分钟(加之前吹干净标本上的水)

　　(15)PBS冲洗三次，每次3分钟

　　(16)用洗耳球吹去标本上多余的液体，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液(试剂C)，37℃湿盒中孵育20分钟。

　　(17)DAB(二氨基联苯胺)显色，使用DAB显色试剂盒。试用前先用蒸馏水将B显色液(1：25)稀释为工作液，然后用此稀释液将A显色液按1：25稀释(避光)。稀释步骤如下：取去离子水920ul，加入B显色液40u1混匀，再加入40u1的A显色液，充分混匀后立即使用，滴加加至玻片，室温显色10分钟，此时本底较浅且达到适当显色强度，用自来水冲洗以终止显色反应。显色时间过长可引起本底增高。

　　(18)如果不需要复染则直接封片

　　(19)复染(根据需要进行)

　　a.苏木精1.3分钟(也可根据苏木精的配制时间灵活掌握这一步时间，有时可以短到十几秒时间)

　　b.自来水冲洗2分钟

　　c.1%盐酸分化1-4秒

　　d.自来水冲洗2分钟

　　e.2%氨水反蓝数秒(使核更蓝)

　　f 自来水冲洗2分钟

　　g.70%酒精，80%酒精，90%酒精中浸泡各5分钟。然后100%酒精，100%酒精中浸泡各10分钟。在以上各个酒精中浸泡时间也可简化为每个1分钟，片子质量所受影响不大。

　　h.风干后，树胶封片晾干。(因为树胶里面已经加了二甲苯，所以这一个步骤之前不用二甲苯处理，否则这个步骤之前须用二甲苯处理)

　　2.9统计方法：各组小鼠胸腺指数、脾指数、血清IL.2间的比较用Mann.WhitneyU检验，荷瘤小鼠免疫组织化学染色CD25+细胞阳性率、Cleaved-caspase3阳性率间的比较用卡方检验。

　　结果

　　移植瘤生长情况及荷瘤成功率：在整个实验过程中，人参皂苷Rh2灌胃组、5-FU腹腔注射治疗组的荷瘤小鼠均生长良好，进食、饮水正常，未出现明显消瘦等表现。而酒精灌胃对照组荷瘤小鼠在实验后期明显消瘦，皮毛稀疏、无光泽。各组小鼠在荷瘤1周后，接种部位可触及小结节，以后逐渐呈类圆形或椭圆形生长，至实验结束时(荷瘤5周后)接种部位可见明显膨隆瘤结节(图片见附录)。在整个实验过程中无小鼠死亡。该实验32只BALB/c小鼠结肠癌皮下移植瘤模型的成瘤率为87.5%。

　　3.1人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，其抑瘤率为81.76%，5-FU腹腔注射治疗组与酒精灌胃对照组相比，其抑瘤率为90.32%，计算公式见附录。

　　3.2人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞表达

　　Cleaved-caspase3的影响(图片见附录)：检测方法：在倒置显微镜下观察，阳性细胞为胞浆染色。每个病理切片随机计数5个400x视野，求出平均每个高倍视野网格

　　内阳性细胞百分率。人参皂营Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved.caspase3表达率明显增加(P<0.01)，具有统计学意义，提示人参皂苷Rh2(0.4%乙醇混悬液)能够促进小鼠结肠癌CT-26的凋亡。

　　人参皂苷Rh2(0.4%乙醇混悬液)灌胃治疗组与5.FU腹腔注射治疗组相比，小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved—caspase3表达率不及后者(P<0.01)。结果如表1所示：

　　3.3 5-FU腹腔注射治疗组同人参皂苷Rh2灌胃组、酒精灌胃对照组相比胸腺指数、脾脏指数、血清IL-2水平均明显降低(P<0.05)，结果见表2、表3。

　　3.4人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的免疫指标的影响：

　　3.4.1人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的免疫器官的影响：在该实验中人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠的胸腺指数、脾脏指数略大于后者，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果如表2所示。

　　3.4.2 人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的细胞因子的影响：人参皂苷IL-2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠的血清IL-2测定值略大于后者，但差异无统计学意义(p>0.05)，结果如表3所示。

　　3.4.3人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠皮下移植瘤内的CD25+细胞的影响：检测方法同前，阳性细胞为细胞膜染色。人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠皮下移植瘤内的CD25+细胞浸润无明显增多(P>0.05)，结果见表1。

　　3.5小鼠荷瘤以后，胸腺指数、脾脏指数、血清IL-2水平均较正常小鼠降低(P<0.05)，与前人动物实验结果一致，结果见表2、表3。

　　讨论

　　传统中药人参(PanaxginscngC.A.Mey.)为五加科植物人参的干燥根，其性

　　平，味甘、微苦，归肺、脾、心经。具有大补元气，补脾益肺，生津，安神益智之功。是补气类中药的要药。倍受历代医家推崇。在科学技术快速发展的今天，借助现代医学研究技术手段，目前发现人参含有近40种人参皂苷单体及人参倍半萜烯、人参酸、人参英(Saponin)、人参奎酮、人参宁(Gin2senin)、14种氨基酸和多肽、人参多糖、维生素B1、维生素B2、烟酸、胆碱、微量元素锗等成分。其中人参皂苷是人参的主要成分，包括人参皂苷单体Ro、Rbl、Rb2、Rbc、Rd、Re、Rf、20.葡萄糖Rf,Rgl、R92、R93、Rhl、Rh2、Rh3、Rh4、PD：PT、PPD等，并不断有新成分被发现。各种人参皂苷的作用并不相同，甚至有的作用完全相反，如：Rg类对中枢神经系统具有兴奋作用，而l强类则具有镇静作用，所以将总皂甙用于研究和治疗不易明确其具体机制，目前已趋向于将单体皂甙用于研究和治疗。人参皂苷Rh2是近年从人参中提取的天然活性成分，属于Rh2类单体(Ra2类包括Rhl、R.h2、Rh3、Rh4，其中黜也具有较强的抗癌活性)，分子式C36H6208H20，分子量622，化学名为20(S).人参二醇.3.氧.B.D一吡喃葡萄糖苷，简称Rh2，毒性低，属于小分子物质且为脂溶性，可溶于乙酣81。目前对人参皂苷P,.h2的抗肿瘤作用机制的研究包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、诱导分化、抑制肿瘤DNA合成、提高荷瘤机体的免疫功能、抑制肿瘤转移、抗肿瘤耐药性增强其他化疗药物对耐药肿瘤作用等方面。但对于人参皂苷Rh2的抗肿瘤的作用还需更全面、更系统、更深入的研究。

　　结肠癌(ColonCallcer)是胃肠道常见的恶性肿瘤。以41-65岁发病率高。在我国近20年来尤其是在大城市，发病率明显上升。结肠癌早期症状多不明显，易被忽视。出现症状来医院就诊的患者多为结肠癌中晚期。临床上结肠癌的辅助化疗或肿瘤治疗均以5-FU为基础用药5-FU是常用的嘧啶拮抗剂，在分子结构上与正常尿嘧啶分子相似，是尿嘧啶5位上的氢被氟取代的衍生物。5-FU在细胞内转变为5.氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)，抑制脱氧胸苷酸合成酶， 阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化转变为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而影响DNA合成;此外，5-FU在体内可转化为5.氟尿嘧啶核苷，以伪代谢产物形式掺入RNA分子里，干扰蛋白质的合成。5-FU使细胞核酸代谢出现障碍，进而引起肿瘤细胞的凋亡。5-FU对骨髓和消化道毒性较大，可引起骨髓抑制，降低机体免疫力，引起胃肠道症状，如恶心、呕吐，甚至出现血性腹泻。由于5.FU的毒副作用在一定程度上限制了它的应用。绝大多数的恶性肿瘤与健康组织相比，没有特异性的差别，因此在细胞抑制性治疗时，除了所期望的抗肿瘤作用以外，对于健康的脏器，特别是对于快速增生的组织也有明显的抑制作用，如在化疗工程中出现的骨髓抑制，恶性肿瘤的化疗效果因此也就受到了限制。寻找抗肿瘤作用强而对机体副作用小的药物因而也就成为了迫切需要。

　　研究肿瘤，通常有离体、活体和离体一活体三种方法。离体方法，由于肿瘤细胞系在体外培养，脱离了机体的内环境，其实验结果对人类肿瘤的指导意义不大。离体一活体的方法，只有在研究中有必要时才采用。所以通常应用最多的是活体研究方法。就是实验肿瘤在实验动物身上，研究者可以获得整体动物在荷瘤(包括自发、诱发或移植接种肿瘤)情况下的各种实验研究资料。小鼠的肿瘤，在组织发生上、临床过程上和组织形态学上，都与人类的肿瘤有相似之处。且小鼠个体较小，性情温顺，便于饲养管理，价格经济。因此实验肿瘤研究常选用小鼠，尤其是各种高癌和低癌品系的近郊系小鼠。进行抗癌肿瘤新药的研究和筛选，可选用移植性实验肿瘤。这类肿瘤模型的优点是：接种一定数量的肿瘤细胞或病毒性肿瘤的无细胞滤液后，可以使一群实验动物带有同一种肿瘤，生长速度较为一致，个体差异较小，可以有较高的成活率。对宿主的影响也类似，易于客观地判断疗效;可在同种或同品系的实验动物中连续移植，长期保存供反复实验之用;实验周期一般也比较短。此次实验遵循上述原则，选用与BALB/c小鼠同源的小鼠结肠癌CT-26细胞系，接种于BALB/c小鼠的皮下，保证了较高的成瘤率。

　　4.1人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞表达Cleaved—caspase3的影响

　　半胱氨酸天冬氨酸.特异性蛋白酶(caspase)，属于ICE/CED-3(人白介素lB转化酶/ced.3基因蛋白)蛋白酶类。目前己发现其家族成员至少有14个，且与所有细胞凋亡的发生有关;其qbcaspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3分procaspase-3、activecaspase-3和cleaved caspase-3。

　　未活化的Caspase-3即procaspase-3，正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，是细胞的组成性表达分子，当受到外界因素诱导活化后成为active caspase-3即活化的caspase-3，不断地由胞浆向胞核转移，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。 Active caspase-3还参与细胞在增殖或分化过程中的正常生理性凋亡过程。而cleaved caspase-3仅是active caspase-3上的一个大片段，可以特异性地反映机体发生异常的凋亡。

　　细胞凋亡(apoptosis)，又称细胞程序性死亡(programmedcelldeath)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其特征为细胞内出现凋亡小体。当细胞接收到死亡信号后，细胞出现一系列形态特征和生化特征，形态特征表现为细胞体积变小，细胞质浓缩，胞膜结构完整，有泡状突起，细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围、细胞膜内陷，最后细胞裂解成许多有膜包裹的颗粒即凋亡小体;生化特征表现为染色质DNA断裂，形成180～200bp整数倍的DNA片段;细胞内的酶被激活;细胞内活性氧分子增多、胞浆钙离子升高。膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面线粒体膜电位消失，膜通透性变大，细胞色素C被释放。细胞凋亡在生物体生长发育过程中具有十分重要的意义，对保持正常组织的平衡稳定也起着重要作用。但它也出现在病理状态下，尤其在肿瘤的细胞生物学方面。

　　目前比较清楚的细胞凋亡机制主要有：

　　1)细胞凋亡的死亡受体途径(Deathreceptorpamway)或称外源性通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体包括Fas、TNFR、TRAIL等。

　　Fas是一种跨膜蛋白，又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，属于肿瘤坏死因子受体家族成员，它与FasL(Fasligand，Fas配体或称死亡配体)结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成DISC(Deathinducingsignalingcomplex，凋亡诱导复合物)，这个复合物中包括FADD(Fasassociation protein withdeath，带有死亡结构域的Fas相关蛋白)。FaSL一旦和受体Fas结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域(DD，deathdomain)。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端(DD)和N端(DED，Deatheffectordomain，死亡效应域)部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8(procaspase8)酶原的前导区的DED结合，募集多个proeaspase8的分子，procaspase8分子便由单链酶原转成有活性的双链蛋白，即Caspases8，随后Caspases8激活以酶原形式存在细胞质中的procaspase3、procaspase6、procaspase7。三者被激活后分别生成caspase3、caSpase6、caspase7。三者再酶解相应底物，包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，DNA降解，以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。

　　Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，通常能够有效地引起靶细胞凋亡。

　　TNF(Tumor necrosisfactor，肿瘤坏死因子)：包括TNFa、TNFl3。TNF(3t,由活化的单核巨噬细胞产生，亦称恶液质素;TNFl3f13活化的T细胞产生，亦称淋巴毒素。两种TNF的分子量为51kD，结构为同源三聚体，TNF-a和TNF.13都可以分别与TNFRI(Tumornecrosisfactor receptorI，肿瘤坏死因子I型受体)或TNFRII(TumornecrosisfactorreceptorII，肿瘤坏死因子II型受体)结合，并且与这两型受体的结合基本上没有选择性。TNFRI胞浆区有一个约80个氨基酸的DD区(deathdomain，死亡结构域)，TNF与TNFRI结合后，TNFRI三聚体化，通过DD区，TRADD(TNFreceptor-associated deathdomainprotein，肿瘤坏死因子受体相关的死亡结构域蛋白)一方面与TNFRI的胞浆区结合，另一方面与FADD的C一端部分结合，通过FADD的DED区，Procaspase-8被募集在DISC上。聚集(拘Procaspase.8或10，通过自身或相互切割产生成熟的CaLspase-8或10。二者随后激活以酶原形式存在细胞质中的procaSpaSe3、procaspase6、procaspase7。三者被激活后分别生成caspase3、casp僦、caspase7。三者再水解相应底物，最终导致细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与Fas/FasL通路类似。

　　TRAIL又称凋亡蛋白2配体(Ap02ligand)，由281个氨基酸组成，分子量32kD;其胞膜外C端区域与FasL和TNFa的同源性分别为28%及23%;TRAIL受体：包括DR4和DR5。DR4，又称Apo-2或TRAILRl(凋亡蛋白2配体受体)，在C端的胞浆区有DD区，与TNFRI相应的结构域有30%的同源性。DR5(TRAILR2)，胞浆区有DD区。在正常和肿瘤细胞中，DR4和DR5分布均非常广泛，该通路最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性。TRAIL与DR4、DR5结合后，可能是其C端的胞浆区的DD区与FADD的C.端部分结合，通过FADD的DED区，Proeaspase-8被募集在DISC上。聚集的Procaspase-8或10，通过自身或相互切割产生成熟的Caspase-8或10。二者随后激活以酶原形式存在细胞质中的procaspase3、procaspase6、procaspase7。三者被激活后分别生成caspase3、caspase6、caspase7。三者再水解相应底物，最终导致细胞发生凋亡。

　　2)细胞凋亡的线粒体途径(Mitochondrialpathway)或称内源性通路：

　　线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且还是细胞内源性的死亡信号所诱导的细胞凋亡调控中心。实验中发现如果用凋亡分子刺激细胞，细胞色素C便从线粒体释放到细胞质中，然而当用细胞色素C的抗体特异地除掉细胞色素C后，细胞质裂解液不能结合dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)，因而细胞凋亡也就不能进一步进行。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是内源性细胞凋亡的关键步骤。细胞内部的死亡信号源自各种因素，如DNA损伤、氧化应激、X一射线、化疗药物、营养缺乏等。细胞接受到内部的死亡信号后，BH.3only亚族蛋白和Bax亚族蛋白相互作用，促使Bax亚族蛋白寡聚化，并进入线粒体，引起线粒体跨膜电位(△、I，)消失和线粒体渗透转运孔(PTP)的开放促使线粒体释放细胞色素C和Smae/DIABLO(线粒体膜间蛋白)，释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子l(Apaf-I)结合，使其形成多聚体，并促使procaspase-9与其结合形成凋亡小体，procaspase-9被激活，生成caspase9，随后caspase9激活下游的procaspase3、procaspases7，生成有活性的caspase3、caspase7，二者引起级联放大反应，激活其他参与细胞凋亡的caspase酶，被激活的caspase酶水解相应胞浆中的底物，从而诱导细胞凋亡。

　　细胞凋亡并不完全是个线性通路。其实细胞凋亡中信号分子间相互影响，构成了细胞凋亡的环性通路一死亡环(Deathcycle)。在这个死亡环里，caspases、细胞色素相互作用：细胞色素能激活procaspase，而有活性的caspase也能刺激线粒体释放细胞色素C。这样，上游(upstream)分子和下游(downstream)分子的凋亡信号呈级联放大效应。

　　在该实验中人参皂苷Rh2灌胃组与酒精灌胃对照组相比，小鼠皮下移植瘤内的早期凋亡肿瘤细胞Cleaved—caspase3表达率明显增加(P<0.01)，具有显著统计学意义，提示人参皂苷Rh2以O.4mg/kg标准(0.4%乙醇混悬液)经口服能够促进小鼠结肠癌CT-26的凋亡。其抗肿瘤作用虽不如5.FU，但未见明显毒副作用，其机制很可能是通过死亡受体中的TRAIL或线粒体途径来诱导小鼠结肠癌CT-26细胞凋亡的，具体机制有待于进一步深入研究。

　　人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的免疫系统的影响

　　恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关。免疫系统具有免疫防御，免疫监视，免疫耐受，免疫调节四大功能。免疫系统的基本生理功能是对“自己”和“非己”抗原分子的识别与应答，负责防御病原体侵害，监视和防止体内细胞恶变及异常增殖， 维持机体内环境稳定， 以消除疾病和保证机体健康。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。人参皂苷Rh2对荷结肠癌小鼠的免疫器官的影响小鼠的免疫器官包括胸腺、脾脏，二者在免疫系统中发挥着重要作用。胸腺为初级(中枢)淋巴器官，是T淋巴细胞分化和发育的场所，与细胞免疫有关，同时能调节机体免疫系统功能，建立自身耐受并维持自稳功能;脾脏为次级(外周)淋巴器官，是各类免疫活性细胞定居并在此进一步增殖、分化和成熟的场所;同时也是免疫活性细胞对抗原物质产生免疫应答的场所，脾脏中有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞，与体液免疫、细胞免疫均有