人参皂甙Rh对耐药乳腺癌细胞P-糖蛋白和基质金属蛋白酶及其诱导物表达的影响

　　人参皂甙 Rh 对耐药乳腺癌细胞

　　P-糖蛋白和基质金属蛋白酶及其诱导物表达的影响

　　摘要: 目的 观察人参皂甙 Rh对人乳腺癌 MCF7 /Adr细胞 P糖蛋白(Pglycop rotein, Pgp) 、基质金属蛋白酶诱导物(extracellular matrix metallop roteinase inducer, EMMPR IN) 和基质金属蛋白酶(matrix metallop roteinases 1,MMP1)、MMP2、MMP9表达的影响。

　　方法　采用 MTT比色法检测药物对 MCF7 /Adr细胞的毒性作用;流式细胞仪测定细胞内阿霉素 adriamycin,ADM的荧光强度; Real time RTPCR和 W estern blot检测细胞 Pgp、EMMPR IN、MMP1、MMP2和 MMP9 mRNA 和蛋白水平的变化。

　　结果 ADM 组与对照组相比,ADM 能上调细胞 Pgp、EMMPR IN、MMP1、MMP2和 MMP9蛋白表达;人参皂甙 Rh2 能抑制 ADM 对 细胞 Pgp、EMMPR IN、MMP1、MMP2和 MMP9蛋白和 mRNA 水平的上调作用。

　　结论　人参皂甙 Rh 可以有效逆转乳腺癌细胞耐药细胞系 MCF7 /ADM 的耐药性。

　　关键词:乳腺肿瘤;基质金属蛋白酶;人参皂甙 Rh ;多药耐药

　　Effect on the expression of Pglyeoprote in, extracellular ma tr ix m eta lloprote inase inducer , and ma tr ix m eta lloprote ina se in m ultidrug resistan t brea st cancer cells treated w ith gen sen oside Rh2

　　P IAO L ihua , HAN Chunji , J IN Yuanzhe , CHEN Q i , XU Zude

　　(1D epartm en t of A natomy and H istology and Em bry ology, M ed ica l College of Yanbian Un iversity, Yanj i　133000, Ch ina; 2D epartm en t of

　　P reven tiveM ed icine, Yanbian Un iversity College of B asicM ed icine, Yanj i　133000, Ch ina; D epartm en t of Pathology, Shangha iM ed ica College, Fudan Un iversity, Shangha 　200032, Ch ina; D epartm en t of Pa thology, Huashan Hosp ita l, Fudan Un iversity, Shangha i

　　200040, Ch ina) Abstract: Purpose　To investigate the effects of gensenoside Rh2 on Pgp , EMMPR IN ,MMP1 and MMP9 exp ression in human multi drug resistant breast cancer cells. M ethods　The toxicity of the drugs to MCF7 /Adr cells was assessed byM TT colorimetric assay; the fluorescence intensity of adriamycin (ADM ) in MCF7 /Adr cellswas detected w ith flow cytometry analysis, Exp ression of Pgp , EMM PR IN ,MMP1,MMP2 and MMP9 was detected byW estern blot analysis and reverse transcrip tion and quantitative realtime polymerase chain reaction ( realtime RTPCR) . Results　Compared w ith the control group , Pgp , EMMPR IN ,MMP1,MMP2 and MMP9 exp res sions were up regulated by ADM and the up regulation was inhibited by gensenoside Rh2 at both mRNA and p rotein levels. Conclusion s Ginsenoside Rh2 may effectively reverse the resistance ofMCF7 /ADM cells.

　　Key words:breast neop lasmas;MMP; Gensenoside Rh ;multiidrug resistance MDR

　　肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药药 multip le drug resistance,MDR ) 是临床上化疗失败的主要原因。本课题组在前期研究中发现肿瘤 MDR 与浸润转移之间存在着一定的内在联系,耐药细胞株比其相应的敏感细胞株表达更高的基质金属蛋白酶诱导物 ( extracellular matrix metallop roteinase inducer, EMMPR IN ) ,分泌 MMP 也明显增加。用 Pgp 的底物长春新碱、紫杉醇和阿霉素孵育 MCF7 /Adr 细胞 ,可以引起细胞 EMMPR IN、Pgp、MMP1、MMP2和MMP9表达升高,细胞迁移能力增强[ 1] 。以上研究提示临床上不恰当的化疗有可能促进癌细胞的浸润转移 ,对肿瘤患者的病情产生不利影响。克服肿瘤细胞的耐药性 ,提高抗癌药物的疗效 ,是目前临床上急需解决的问题。人参及其单体因毒副作用小且有逆转肿瘤耐药的作用 , 国内外一些学者先后报道人参单体 Rh2对多种肿瘤细胞如小鼠黑素瘤 B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞 SKHEP1等具有抑制增殖和诱导凋亡作用 但有关人参单体 Rh2对耐药肿瘤细胞侵袭、转移相关基因的研究报道甚少。本研究以耐阿霉素乳腺癌细胞系 (MCF7 /AdrR) 作为靶细胞 ,探讨人参单体 Rh2 对耐药乳腺癌细胞侵袭转移相关基因 MMP1、MMP2、MMP9 及其诱导物 EMMPR IN 表达的影响及意义。

　　1 材料与方法

　　1. 1　材料　人耐药乳腺癌细胞 MCF7 /Adr购自中科院上海细胞研究所;人参单体 Rh2购自上海融禾公司;盐酸阿霉素购自浙江海正公司;四甲基偶氮唑盐购 自上海实生生物公司; 鼠抗 Pgp单克隆抗体购自 Calbiochem 公司;兔抗 EMM PR IN、MMP1、MMP2、MM9 多抗购 自 Santa Cruz 公司; 鼠抗 actin 单克隆抗体购 自 Sigma 公司;二抗羊抗兔及羊抗鼠 购自 Rockland公司; Trizol购自上海生工生物工程公司;M MLV 逆转录酶购自 Pro mega公司; SYBR Prem ix Ex Taq购自 TaKaRa公司; CO2 培养箱购自 Thermo Forma公司;垂直式电泳仪和湿转装置购自B ioRad公司; TGradient PCR 仪购自B iom etra公司; ROTOR Gene 3000 荧光实时定量.

　　1. 2　M TT法检测药物的细胞毒性 　MCF7 /Adr 以4 ×10 个细胞 /孔接种于 96孔板 ,用含 10%NB S的RPM I 1640完全培养液培养。当细胞长至 30%的融合度时,换成 RPM I 1640无血清培养基并加入相应的药物。每组均设 6个复孔。当细胞培养至 48h, 加 MTT 5 mg/m l 20 l/孔 ,于 37 ℃, 5% CO2 培养箱孵育 4 h,弃去培养液 ,加 150l二甲基亚砜 DM SO) ,振荡至结晶充分溶解 ,用酶标仪检测 490 nm处吸光度值 OD490。细胞存活率 % = 实验组OD490 /空白对照组 OD490 ×100% 。实验均至少重复 3次。

　　1. 3　流式细胞仪将 1×10/m l细胞接种于6孔培养板中,待细胞生长至 50% ～60%融合时,用含05%新生牛血清的 1640培液同步化 20 h,加入相应的药物继续培养 48 h后加入阿霉素至终浓度为 1 g/m l,继续培养 1 h 后消化 ,用预冷的 PB S吹打 , 4 ℃离心 , 2 000 r/m in ×5 m in,弃上清;加入 PB S重悬细胞 ,送中国科学院上海细胞生物研究所作流式细胞仪检测细胞内阿霉素自发荧光强度 ,激发光波长 488 nm ,发射光波长 575 nm ,实验至少重复 3次。

　　1. 4　Rea l tim eRT PCR法检测 m RNA　当细胞生长融合至 30% ～40%时,MCF7 /Adr细胞的培养液中分别加药物 , ADM 组: ADM 终浓度 1μ+ADM 组: ADM 浓度为 1 μg/m l, Rh 终浓度分别为 5μmol/L , 10μ mol/L , 20μmol/L , 40μ mol/L;不加药的组作为空白对照组:加入等量的溶剂。药物作用 48 h之后 ,收集细胞并加人 10 m l TR Izol Rea geant提取总 RNA ,用逆转录试剂盒 ( Invitrogen 公司 合成 cDNA ,具体操作按试剂盒说明书中的建议进行。各检测基因引物序列如下: Pgp : 上游 5 AATGCGACAGGAGATAGG3,下游 5TGTTGCCATT GACTGAAA 3 (产物长度 133bp , 退火温度 502℃ ; MMP1: 上游 5CTGAAAGTGACTGGGAAAC3,∶下游 5GGCAAATCTGGCGTGTAA 3 (产物长度 163) bp ,退火温度 600℃ ; MMP2: 上游 5ACCCTCA GAGCCACCCCTAA 3,下 游 5A GCCAGCA GT GAAAAGCCA G3产物长度 241 bp ,退火温度 564℃ ;MMP9:上游 5TCCCTGGAGACCTGAGAACC3, 下游 5CGGCAA GTCTTCCGA GTAGTT3 (产物长度308 bp , 退火温度 618℃ ; CD 147: 上游 5CA GAGTGAAGGCTGTGAAGTCG3, 下 游 5TGCGAG GAACTCACGAAGAA 3产物长度 177bp ,退火温度54℃ ; GAPDH:上 游 5CATCAAGAA GGTGGT GAAGC3, 下 游 5GGAAATTGTGA GGGAGATGC3产物长度208bp , 退火温度 53℃ 。反应利用SYBRGreen PCRM aster M ix Invitrogen 公司 在 Ro torGene3000型荧光定量 PCR 仪上进行。首先 95℃预变性 10 m in,然后按下列程序扩增 40个循环: 95℃变性30s,退火 45s, 72 ℃延伸 45s。上述反应以 GAPDH 作为内参照 , 以各样本拷贝数与 GAP DH 拷贝数的比值作为各自的相对拷贝数。实验均至少重复 3次。

　　1. 5　W estern blot检测 　当细胞生长融合至 30%～40%时,MCF7 /AdrR 细胞的培养液加入相应的药物作用 48 h后 ,细胞裂解液提取细胞总蛋白,定量后取等量样本行 SD SPA GE 电泳分离 ,然后将蛋白转移至 PVDF膜上。将膜在封闭液中封闭 2 h,分别与 Pgp , CD 147,MMP1,MMP2和 9 以及actin 的一抗 4 ℃孵育过夜。加入 IRDyeTM800标记的羊抗兔IgG或 IRDyeTM700DX 标记的羊抗小鼠 IgG,避光37 ℃孵育 1 h; TB ST室温洗膜 5 m in×3 次,用 L I COR 公司的 Odyssey进行荧光显色并测定反应条带灰度值 ,以 actin作为内参 ,计算相对值 ,实验均至少重复 3次。

　　1. 6　统计学方法 　用 SPSS 10. 0 软件完成统计学处理 ,实验数据以 x ±s表示 ,组间分析比较采用 t检验。

　　2　结果

　　2. 1　人参皂甙 Rh2 和阿霉素的细胞毒作用 　MTT检测结果显示 , 02～14 ( g/m lADM 作用于MCF7 / Adr细胞 24 h,细胞存活率 ≥95% ,与对照组相比其差异无显著性 P > 005 ; ADM 作用于细胞 48 h, 12、14 g/m l的 ADM 对细胞有较强的杀伤作用 , 细胞存活率分别为 68% , 52% (P < 005) ,而细胞对02、04、08、10μg/m l的 ADM 完全耐受表 1 5、10、20、40μmol/L 的人参皂甙 Rh2作用于 MCF7 / Adr细胞 48 h细胞存活率 ≥90% ,与对照组相比其差异无显著性 P > 005 ; 80, 160 mol/L人参皂甙Rh2对细胞存活有影响 P < 005,表 2 ,因此 ,在实验中 ADM 和人参皂甙 Rh2分别采用无细胞毒性的10μg/m l和 5～40μmol/L 的浓度。

　　2. 2　人参皂甙 Rh2的耐药逆转作用　MTT检测结果显示 5、10、20、40 μmol/L 的人参皂甙 Rh2μg/m l的 ADM 联合应用 ,细胞存活数分别是单用ADM 组的 63% 、50% 、31% 、28% ,其差异均具有显著性P < 005,表 3 ,表明人参皂甙 Rh2能增强ADM 对 MCF7 /Adr细胞的毒性作用。通过检测细胞内荧光强度发现 , 5 ～40 mol/L 的人参皂甙 Rh2与 10g/m l的 ADM 联合应用细胞 ,细胞内 ADM荧光强度分别是 10 μg/m l的 ADM 单独作用组的109、155、161、237 倍 ,其差异具有显著性 P <2　结果005,表 4) ,表明人参皂甙 Rh2能减少 ADM 的外排 ,提高 ADM 在细胞内的蓄积 ,从而增强 ADM 对肿瘤细胞的杀伤作用。以上结果显示人参皂甙 Rh2具有明显的耐药逆作用 ,并呈浓度依赖性。

　　2. 3 　人 参 皂 甙Rh2对Pgp、EMM PR IN和对 Pgp、EMM PR IN 和MM P1、MM P2、MM P9蛋白和 m RNA 水平的影响 首先 ADM 对细胞 Pgp、EMMPR IN 和 MMP1、MMP2、MMP9 蛋白表达的影响, Real tim e RTPCR细胞存活率和 W estern blot检测结果显示 10 μg/m l ADM 作用于 MCF7 /Adr细胞 48 h,与对照组相比,细胞 Pgp、EMMPR IN 和 MMP1、MMP2、MMP9蛋白和 mRNA 水平升高P < 005,进而我们又观察了人参皂甙Rh2对细胞 Pgp、EMMPR IN 和 MMP1、MMP2、MMP9表达的影响。结果显示当人参皂甙 Rh2与 ADM 联合应用时,人参皂甙 Rh2能明显抑制 ADM 对细胞上述蛋白和 mRNA 水平的上调 P < 005参皂甙 Rh2对上述蛋白表达的下调与人参皂甙 Rh2浓度相关 ,呈浓度依赖性 ,人参皂甙Rh2与 10μmol/L 时作用最为明显.

　　能增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性和肿瘤细胞的转移特性是肿瘤临床治疗中难题。多药耐药可能是一种或几种机制联合作用的结果,但最受人们关注的是多药耐受肿瘤细胞膜上的过量表达的 Pgp ,它可以快速地把药物从细胞内泵到细胞外 ,降低细胞内药物浓度 ,从而导致细胞耐药。研究表明MMPs和EMMPR IN 与肿瘤的侵袭转移有着密切的关系[4 ] 研究证实,MMPs等多种蛋白水解酶介导的细胞外基质及基底膜的降解使肿瘤侵袭转移的一个关键步骤[ 5, 6 ] 。目前至少已知有 20余种 MMPs存在 ,其中MMP1、MMP2 和 MMP9被认为与乳腺癌关系密切 , 特别是与乳腺癌的侵袭性 ,转移以及骨破坏有关 ,并且肿瘤侵袭转移的能力与其产生或诱导产生金属蛋白酶的能力成正相关。CD 147是一种新发现的细胞表面黏附因子 ,属于免疫球蛋白超家族 ,在肿瘤组织和滑膜组织高表达。肿瘤细胞表达的 CD 147 分子可以通过刺激成纤维细胞和内皮细胞产生数种MMPs,也可以自分泌的方式增加 MMPs的合成 ,从而提高了肿瘤细胞的侵袭性[ 7 ] 。由于现今的化学和生物的耐药逆转剂对机体的毒性很大 ,许多学者的目光转向于天然药物 ,研究发现某些中药单体或提取成分毒性小,且药物作用较温和 ,能逆转 MDR 并提高化疗效果[ 8 ] 。人参为五加科多年生草本植物 ,其成分具有诸多生物活性成分。人参皂甙 Rh2是从人参中提取的天然活性成分 ,分子式为 C36H62O8H2O ,相对分子质量 622,化学名为 20βS人参二醇3氧D 吡喃葡萄糖苷 ,简称 Rh2,毒性低 ,属于小分子物质且为脂溶性 ,容易通过血脑屏障[ 9 ] 。大量实验已证实, Rh2可以抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长 ,并证明对正常细胞毒性作用甚低。在本实验 中也发现人参皂甙2Rh2能增强MCF7 /Adr细胞对 ADM 的敏感性 ,提高 ADM 在细胞内的聚积 ,同时人参皂甙 Rh2也能明显抑制 ADM对细胞 Pgp 水平的上调 ,从而证实人参皂甙 Rh2 确实具有耐药逆转作用 ,并且其耐药逆转作用与 Pgp有关 , Rh2作为钙通道阻滞剂与抗肿瘤药物竞争 P gp 的结合位点,从而抑制其跨膜泵作用 ,使抗肿瘤药物的细胞外排降低 ,提高细胞内药物浓度而逆转耐药 。

　　此外 ,人参皂甙可以通过 PKC信号途径增强Ca2+活化的 C I 电流 ,而持续应用人参皂甙则可以诱导 C I 通道的脱敏作用 ,即经人参皂甙持续作用后致 C I 通道失效。从而可能抑制 Pgp “氯离子通道 ”功能。PKC活性增加也是一种肿瘤细胞耐药的机制。PKC 的这种作用主要是通过 PgP 磷酸化并使其功能增强而实现的。有研究结果提示 Rh2可能通过降低细胞内 Ca2+来抑制 PKC 的转位和激活, 并通过抑制细胞内 PKC 蛋白表达 ,最终阻碍 PKC介导的信号转导过程[ 11] 。这也可能是抑制 Pgp 功能的机制之一。本课题前期研究发现 Pgp 底物药物 ADM 等促进 EMMPR IN 的表达 ,进而上调 Pgp MMP1,MMP2和 MMP9 的表达 ,从而维持肿瘤细胞 MDR 表型,增强肿瘤细胞浸润转移能力。Pgp 中和抗体可以阻断上述效应 ,而非 Pgp 底物药物博来霉素则无上述作用[ 12, 13 ] ,提示 Pgp 的活性或药物泵功能在此过程中起重要作用。在本次实验中也发现 Pgp 底物ADM 促进了 MCF7 /Adr 细胞 EMMPR IN、Pgp 和MMP 的表达. 这与我们前期研究结果是一致的。同时我们还观察到 ADM 与人参皂甙Rh2联合作用时能下调细胞 EMMPR IN、Pgp 和 MMP 的表达。提示人参皂甙 Rh2有可能直接或间接,比如可能通过抑制 PKC活化而抑制 Pgp 的磷酸化 作用于 Pgp ,使其功能减退或失活 ,从而阻断了 ADM 对细胞 EMM PR IN、Pgp、MMP1、MMP2和 MMP 的上调作用 ,且人参皂甙 Rh22浓度越高,其作用越明显 ,这也间接证明Pgp 的功能状态在维持耐药细胞 EMMPR IN、P gp 和 MMP 的高表达 ,维持肿瘤 MDR 表型中发挥着重要的作用 ,而人参皂甙 Rh 可抑制 PgP 的这种作用。总之 ,人参皂甙 Rh2作为人参天然活性成分之一 ,以其毒性低、分子量小、脂溶性好、具有很强的抗肿瘤活性等优势 , 已成为国内外众多学者的研究热点。以往的经验也证实中药联合化疗药 ,可以增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性 ,具有减毒增效的效果, 本研究充分证实了它是一种高效的、特异性抑制 P gp 功能的MDR逆转剂。中医药对肿瘤的治疗是多靶点的,是多种异常传导信号长期综合作用的结果。尽管还没能全面揭示并 Rh 逆转肿瘤的耐药确切机制 ,但已初步形成 Rh2防治肿瘤研究的一个新动向, 而其机制也必将随着研究的深入更加清晰,为临床有效防治肿瘤疾病带来希望。

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