人参皂甙Rh2抗肿瘤作用的研究

　　赵　越,苏　适

　　作者单位：(长春生物制品研究所,吉林长春　130062)

　　出处：微生物学杂志2003年3月第2期

　　摘　要　作为中国传统中药的人参在中药史中占有重要的地位,被用于多种古方验方的主药。其主要成分人皂甙具有多种药理作用,其中二醇组皂甙Rh2为从人参中提取的天然活性成分,经现代医学研究证明具有很高的抗肿瘤活性,对肿瘤细胞具有分化诱导、增殖抑制、诱导细胞凋亡等作用。

　　Study on Anti-tumor Activity of Ginsenoside Rh2

　　ZHAO Yue,SHU Shi(Chang chun institute of biological products, changchun 130062)

　　Abstract　Ginseng as a traditional Chinese herbal drug plays a leading role in history of herbal drugs, which is used as ma-

　　jor drug in all kinds of conventional herbal drugs. Protopanaxdiol is the main natural active ingredient in ginseng. In recent

　　medical research it shows that protopannaxdiol not only has high anti-tumor function, but also can induce differentiation ,sup-

　　press growth and induce apoptosis of tumor cells.

　　Keywords　ginsenoside-Rh2,anti-tumor,apoptosis.

　　词　人参皂甙Rh2;抗肿瘤;细胞凋亡

　　中图分类号　R282.71　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2003)02-0061-03

　　人参(Panax ginseng C.A)为五加科多年生草本植物,其成分具有诸多生物活性,为研究者所瞩目并进行了深入的研究,现代医学研究表明人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用[1]。人参皂甙是人参中一类主要的有效成分,迄今已确定结构的至少在30种以上,人参皂甙Rh2是由人参中提取的天然活性成分,属于二醇组皂甙,自从Odashima报告了从红参中提取的有效成分Rh2在体外对黑色素瘤B16细胞具有分化诱导作用后[2],各国学者先后通过多种体内外实验证实,Rh2可以通过诱导分化或调亡,抑制多种肿瘤细胞的增殖与生长,并证明对正常细胞的毒性甚低,现将近几年有关人参皂甙Rh2针对肿瘤细胞生物作用研究综述如下。肿瘤治疗一般分为外科手术、放射疗法、化学疗法3种。肿瘤化疗的目的是通过化学药物杀伤肿瘤细胞,促进肿瘤细胞的死亡或阻止其增殖,但是绝大多数化学药物的细胞毒性缺乏特异性,它在杀死肿瘤细胞的同时,无选择的杀伤正常细胞特别是造血组织细胞,正常细胞的损伤常导致严重的并发症。此外并非所有肿瘤细胞都对化疗敏感,即使对化疗敏感的肿瘤细胞,在停止用药后也易复发。由于肿瘤分化异常在肿瘤发病学上占有重要地位,所以有学者提出使用药物对肿瘤细胞的异常分化进行逆转,即将肿瘤细胞诱导分化为正常细胞或近似正常细胞,作为抗肿瘤药物研究的新途径,而从天然化合物中寻找分化诱导剂成为学者们研究的热点。肿瘤细胞的死亡既可以通过坏死(necrosis)又可以通过凋亡(apoptosis)的形式进行,与坏死不同,凋亡的细胞维持完整的细胞膜结构和功能,细胞解体后形成凋亡小体,不引起周围组织炎症反应,促进肿瘤细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标,越来越多的研究结果使人们从诱导细胞凋亡角度设计新的抗肿瘤治疗方案,以期提高化疗效果。而人参皂甙Rh2正是通过诱

　　导细胞分化和诱导细胞凋亡来发挥其抗肿瘤作用,所以它的抗肿瘤药理作用值得更深入的研究。

　　1　人参皂甙Rh2体外对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用

　　黑色素瘤细胞作为一种分化诱导实验模型,具有独特的优点:黑色素生成能力增加、克隆形成能力降低以及形态改变可以作为分化标记。国内夏丽娟等以小鼠黑色素瘤B16细胞为模型,研究了人参皂甙Rh2对B16细胞的分化诱导作用,结果表明,Rh2在10 mg/L浓度下,对B16细胞有较强的分化诱导作用,表现为黑色素生成能力明显增加;形态向正常上皮样细胞分化;细胞呈网状结构;黑色素颗粒增加;生长变缓慢。酪氨酸是黑色素合成的限速酶,控制黑色素的合成,用10 mg/L浓度的Rh2作用细胞,4 d后酪氨酸活力明显升高,与黑色素生成能力成正比,说明Rh2可诱导B16细胞向正常色素细胞分化。细胞动力学表明,Rh2使B16细胞阻断在G1期,药物作用后,G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,这进一步说明Rh2对黑色素瘤细胞B16具有分化诱导作用,其作用机理值得进一步研究。

　　2　人参皂甙Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

　　韩国Hyun-Eui Kim[3]等在利用小鼠胶质瘤细胞株来观察研究人参皂甙Rh2对脑瘤的潜在作用时发现,人参皂甙Rh2通过引起细胞形态学的改变、DNA断裂、caspase(凋亡活化基因)的激活和活性氧系列(ROS)的产生导致C6胶质瘤细胞的凋亡,在用Rh2处理后,特异性的(ADP-核糖)多聚酶却没有象在其他凋亡实验中出现的那样断裂成85 ku蛋白,Bcl-2和Bax的表达水平也没有发生变化,其过度表达的抗氧化蛋白质Bcl-Xl也与亲本细胞相类似,因此人参皂甙Rh2导致的C6胶质瘤细胞凋亡并非依靠Bcl-Xl的方式,而是通过活性氧系列(ROS)的产生和caspase通路的激活来调节的。国内李殿友等2000年发表文章首次报告了Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖影响,并应用流式细胞术探讨其作用机理。在该实验中

　　发现:①Rh2在浓度为2,4,8μmol/L时对C6胶质瘤细胞有增殖抑制作用,且呈明显量效关系,在实验剂量范围内没有明显细胞毒性;②Rh2作用72h后,浓度为4μmol/L浓度对C6胶质瘤细胞诱导凋亡作用最为明显;③Rh2作用后,G0/G1期细胞百分率明显下降,而S期细胞百分率显著增加;④实验通过流式细胞仪检测到由于核小体间DNA断裂形成的凋亡峰,表明Rh2在一定浓度范围内可以通过诱导细胞凋亡而非细胞毒作用,抑制肿瘤细胞的生长。总之,Rh2对C6胶质瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,并且这种作用具有周期特异性,但是具体作用机理有待于进一步研究。由于Rh2是由人参中提取的天然活性成分,脂溶性毒性低,分子量小,易于通过血脑屏障,是一种潜在的化疗药物,故可与其他周期特异性药物联合应用,提高脑胶质瘤化疗效果。

　　3　人参皂甙Rh2诱导人肝癌细胞

　　SK-HEP-1的细胞凋亡研究

　　韩国汉城大学药学院Jin Y H等人报告了一种环激酶抑制剂p21WAFI/CIPI在通过人参皂甙Rh2处理诱导的SK-HEP-1细胞凋亡的早期阶段,经过蛋白酶解加工成为较小的片段p 14的过程。酶解加工的过程是caspase-3激活所引起的,并伴随着细胞形态学和DNA裂解的早期变化,当与经过Rh2处理的细胞提取物共同孵化时,迁移的p21WAFI/CIPI在体外被切割成一个p 14片段,通过添加一种特殊的caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO,切割被抑制,这种抑制并非单纯的caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CHO所引起的。与此相似,在E.coli中通过再结合caspase-3,p21WAFI/CIPI被有效的切割,突变分析中可以鉴定出2个caspase-3切割位点—DHVD112/L和SMTD149/F,位于周期蛋白Cdks和PCNA相互作用的区域内或周围,之后验caspase-3调制的p21WAFI/CIPI片段是否作为一个细胞周期蛋白Cdk2激酶活性正向调节功能的基本过程,已知这个过程是需要通过不同的刺激诱导凋亡的执行过程,结果显示,人参皂

　　甙Rh2诱导的p21WAFI/CIPI的切割与细胞周期蛋白A/Cdk2活性的提高有关,但与细胞周期蛋白E/Cdk2的活性无关,用人参皂甙Rh2处理之后,在细胞中p21WAFI/CIPI的过分表达有效但部分抑制凋亡和正向调节细胞周期蛋白A/Cdk2激酶活性,抑制作用在与p21WAFI/CIPI(P21D112N)对抗caspase-3分裂的突变异种转移的细胞中更为明显。通过比较,细胞周期蛋白A或Cdk2的过分表达正向调节细胞周期蛋白A/Cdk2激酶的活性和凋亡。这些正向调节作用可被任一个细胞周期蛋白A或Cdk2共同表达的支配的负性Cdk2(Cdk2-dn)有效的阻断。另外,一种特异性细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂olomoucine也能有效抑制通过人参皂甙Rh2诱导的细胞凋亡。综上所述,作者提出人参皂甙Rh2通过与细胞周期蛋白

　　A激酶复合物有关的p21WAFI/CIPI分解蛋白的分裂方式导致SK-HEP1细胞凋亡。p21WAFI/CIPI的蛋白酶解的切断对于细胞周期蛋白A/Cdk2活性的正向调节及人参皂甙Rh2诱导的细胞凋亡的完成都是一个必要的过程。

　　4　人参皂甙Rh2在体外和裸鼠实验中对人卵巢癌细胞(HRA)的生长抑制作用

　　日本Hideyuki Nakata等研究发现[4],Rh2在体外浓度为10~60μmol/L间能够以剂量依赖方式抑制各种已知的人类卵巢癌细胞株的增殖,并且在IC50浓度左右导致细胞凋亡。具体结果是,当HRA被皮下接种于裸鼠右肋侧时,所有的裸鼠在2个星期左右都形成了可触摸的肿瘤。尽管腹膜内单独注射Rh2几乎不能抑制肿瘤的生长,但是当Rh2与CDDP联合作用时,与CDDP单独作用相比,肿瘤生长被明显抑制。当每日口服Rh2时,与CDDP治疗相比,肿瘤生长被明显抑制(P<0.01),当Rh2与CDDP联合作用时,肿瘤生长抑制的程度并未加强。与对照组和单独用CDDP处理组相比,生存时间明显延长(P<0.05)。进一步研究发现,每周腹膜内给予CDDP在1,2,4 mg/kg时,其抗肿瘤活性明显,而每日口服Rh2(0.4~1.6 mg/kg),其抗肿瘤活性不仅可以与服用4 mg/kg的CDDP相媲美,而且还可以使生存时间明显增加。安全实验证明,实验用剂量的Rh2并未导致任何不良反应的发生,这可以通过血细胞比容和小鼠体重得以确认,而4mg/kg的CDDP却导致严重的不良反应。尤其值得注意的是,口服而不是腹膜内给予Rh2会导致肿瘤细胞的凋亡,而且也会使患有肿瘤的裸鼠脾脏细胞的免疫能力得到提高。因此,考虑到CDDP的毒性,单独给予Rh2似乎能够确保对卵巢癌的治疗,并减少复发的机会。

　　5　Rh2分子作用机制研究

　　从以上抗肿瘤效果的研究中发现,未纯化的Rh2在体外培养的Morris肝细胞癌中诱发表型逆转录,而且扣留人肝细胞癌的细胞周期,通过蛋白水解caspase-3的底物(ADP-核糖)多聚酶,激活caspase-3,诱发人肝细胞癌SK-HEP-1细胞的凋亡;纯化的Rh2在G1和S期抑制B16黑色素瘤细胞的细胞周期过程、激发黑色素生成、诱发不能转录的表型的表达;在体内实验中,口服Rh2可以延长皮下接种了人卵巢癌细胞的裸鼠生存时间;最近又发现,Rh2抑制了人类血液中淋巴细胞的姊妹染色体交换的形成;而且人参皂甙的混合物被报道在体外能增加DNA多聚酶的活性等。为了阐明Rh2的分子作用机制,日本的TakahideOta等重点研究了Cdk2,它是细胞周期过程中G1和S期的重要激酶。结果清楚的显示Rh2抑制了在G1期扣留的B16黑色素瘤细胞的Cdk2的活性,而对S期扣留的细胞没有抑制作用。尽管国内外学者通过研究证实了人参皂甙Rh2对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用,并阐明该作用是通过诱导分化和引起细胞凋亡而达到的,从而在分子生物学和细胞生物学方面为Rh2作为抗肿瘤药物奠定了基础,但是其作用机理和发挥抑制作用的信号传导途径仍需进一步探讨,以便在实验基础上开发出更有针对性的可以人工合成的新型抗肿瘤药物,从而解决人参皂甙Rh2在人参体内含量少,纯化复杂的问题。

　　参　考　文　献

　　[1]　国家药典委员会,潘正安.中药大辞典[M].上海:上海科技出版社,2000,3~5.

　　[2]　Odashima S,Ohta T,Kohno H,et al.Control of phenotypic ex-pression of cultured B16Melanoma cell by plant glycosides[J].Cancer Res,1985,45:2781.

　　[3]　Hyun-Eui Kim,J.H.Oh,S.K.Lee and Young J.Oh.Ginseno-side Rh-2 induces apoptotic cell death in rat C6glioma via reac-tive oxygen-and caspase-dependent but Bcl-XL-independentpathway[J].Life Sci.,1999,65:PL33~40.

　　[4]　Nakata,H.,Y.Kikuchi,et al.Inhibitory effects of ginsenosideRh2on tumor growth in nude mice bearing human ovarian can-cer cells[J].Japanese Journal of Cancer Research,1998,89(7):733~740.

　　作者简介:赵越　男,助理工程师。现从事生物制药研究工作。