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20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用

2014-08-04

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导读:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用

  20(S)-原人参二醇对人胚肾293细胞生长的抑制作用*

  【摘要】 目的:研究20(S)-原人参二醇(PPD)对人胚肾293细胞(HEK-293细胞)生长抑制作用。方法:采用台盼蓝染色和噻唑蓝(MTT)法观察PPD对HEK-293细胞增殖的抑制作用,同时通过Hoechst 33258染色和DNA Ladder方法测定PPD对HEK-293细胞凋亡影响。结果:PPD可明显降低HEK-293细胞存活率和细胞活性,半数抑制浓度(IC50)为21.8 μmol/L。PPD处理后HEK-293细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,琼脂糖电泳呈现明显的DNA Ladder条带。结论:PPD对HEK-293细胞生长有明显的抑制作用并有剂量依赖关系。

  【关键词】 20(S)-原人参二醇;人胚肾293细胞;Hoechst 33258;噻唑蓝

  [Abstract] Objective: To study the effects of 20(S)-protopanaxadiol (PPD) on the on cell growh of HEK-293 cell line. Methods: HEK-293 cell line was treated with PPD. The activity of HEK-293 cells was determined with MTT assay. The effects of PPD on apoptosis rate were observed by the Hoechst 33258 dye and DNA ladder. Results: 20(S)-Protopanaxadiol could inhibit the proliferation of HEK-293 cell, IC50 values was 21.8 μmol/L. The morphological changes were observed in the nuclei of HEK-293 cells treated by PPD. The DNA Ladders bands were detected by 1% agrose gel electrophoresis. Conclusion: 20(S)-Protopanaxadiol could inhibit the proliferation of HEK-293 cell in a dose dependent manner.

  [Key words] 20 (S)-protopanaxadiol (PPD); Human embryomic kidney-293 cell(HEK-293 cell); Hoechst 33258; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)肾癌(renal cell carcinoma,RCC)又称肾细胞癌,是肾脏最常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈逐年上升趋势。随着对RCC发生机制认识的不断深入、新药的研发,RCC治疗已取得了很大的进展,但总体效果仍不理想。因此,进一步研究RCC的发病机制,寻找有效的抗RCC药物刻不容缓。20(S)-原人参二醇(protopanaxadiol, PPD)是从西洋参(Panax quinquefolium L)的茎叶中提取的天然抗癌新药,对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用[1-3]。国外学者报道了原人参二醇型皂苷20(S)-人参皂苷Rg3、Rh2及其PPD均具有较强的抑制肿瘤细胞生长作用,其中PPD的体外抑瘤作用更强[4-6]。PPD对黑色素瘤B16、小鼠肝癌H22、肺癌Lewis、宫颈癌HeLa和肺癌A549等癌细胞都有较强生长抑制作用[2,7-9],可使肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌等癌细胞发生程序性死亡, 且凋亡率随PPD浓度升高而增加[9-12]。目前,未见有关PPD对于肾癌细胞生长抑制作用的报道。近年来,由于造血干细胞移植和基因治疗等多种RCC治疗方面的研究取得了可喜进展。人胚肾293细胞(human embryomic kidney 293 cell,HEK 293 cell)具有生长快,易培养,转染效率高等优点,目前利用HEK-293细胞作为腺病毒载体的包装细胞将目的基因导入人体是进行基因治疗研究的热门。本实验采用PPD处理体外培养的HEK-293,并通过多种方法检测PPD对HEK-293细胞的生长抑制作用,为进一步研究PPD的抑癌机制及治疗提供依据。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  PPD(中国药品生物制品检定所);HEK-293细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)。

  1.2 试剂

  台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒、噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒、细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒、细胞凋亡阳性对照试剂盒(碧云天生物技术研究所);RPMI 1640 培养基(Gibcol BRL),Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。

  1.3 实验仪器

  CO2培养箱(Jouan IGO150);酶标仪 (Bio-TEK ELx800);荧光倒置显微镜(Olympus IX51)。

  1.4 方法

  1.4.1 细胞存活率检测

  取对数生长期的HEK-293细胞1 ml接种于24孔培养板(细胞浓度为5×105/ml),细胞培养24 h后, 药物处理组分别加入终浓度为12.5、25、50、100、200 μmol/L PPD,细胞对照组加入相同量的DMSO。药物处理24 h后,先用胰酶消化并收集细胞,1 000~2 000 g离心1 min,弃上清液,用1 ml细胞重悬液重新悬起细胞。吸取100 μl重悬的细胞到塑料离心管内,加入100 μl台盼蓝染色液(2×),轻轻混匀,染色3 min。吸取少量经过染色的细胞,用血细胞计数板计数。细胞存活率/%=(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100%。

  1.4.2 MTT细胞活性检测

  取对数生长期的HEK-293细胞, 调整细胞浓度为5×105/ml,接种于96孔培养板,药物处理组和细胞对照组加入每孔100 μl细胞悬液,每组设3个复孔,空白对照组只加入RPMI 1640全培养基,每孔100 μl,设3个复孔。细胞培养24 h后, 药物处理组分别加入终浓度为12.5、25、50、100、200 μmol/L PPD,细胞对照组和空白对照组加入与处理组等量的DMSO。将96孔培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后,加入5 mg/ml MTT 10 μl,继续培养4 h,每孔加入100 μl Formanzan溶解液,在细胞培养箱内继续孵育,直至普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解。置于酶标仪,测定570 nm的吸光度(A)值, 计算抑制率[抑制率= (1-实验组A值/对照组A值)×100%]。实验重复3次。应用SPSS 11.5PPC 软件作回归方程,计算PPD对肿瘤细胞作用24 h的半数抑制浓度(IC50)。

  1.4.3 细胞核染色质的形态观察

  (Hoechst 33258染色) 取洁净的盖玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更长时间,无菌超净台内吹干,再用细胞培养液洗涤1遍,将盖玻片置于12孔板内,培养的细胞胰酶消化后,调整培养的细胞浓度为5×105/ml ,各取1 ml种入12孔板培养过夜,使细胞生长至50%~80%。药物处理组分别加入终浓度为12.5、25、50、100、200 μmol/L PPD,阴性对照组加入等量的DMSO, 阳性对照组加入细胞调亡诱导试剂A和B各1 μl。继续将细胞37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后,吸尽培养液,加入0.5 ml固定液,固定10 min。去除固定液,用PBS洗2遍,每次3 min,吸尽液体。加入0.5 ml Hoechst 33258染色液,染色5 min。去染色液,PBS洗2遍,每次3 min,吸尽液体。加1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片液,尽量避免气泡。荧光显微镜下检测呈蓝色的细胞核。激发波长350 nm左右,发射波长460 nm左右。

  1.4.4 细胞凋亡DNA片段化检测

  各取培养的细胞(浓度为5×105/ml)1 ml种入12孔细胞培养板37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后,分别加入终浓度为12.5、25、50、100、200 μmol/L PPD,阴性对照组加入相同量的DMSO,阳性对照组加入细胞调亡诱导试剂A和B各1 μl。继续培养24 h后,根据DNA Ladder抽提试剂盒说明提取DNA Ladder。取部分抽提得到的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳分析。

  2 结 果

  2.1 细胞存活率

  不同浓度PPD处理HEK-293细胞24 h后,通过台盼蓝染色方法计算细胞存活率,见图1。细胞存活率/%=(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100%。随着PPD浓度的升高, 细胞存活率逐步下降,不同浓度的PPD对HEK-293细胞均有抑制作用。同时,在显微镜下观察细胞的形态变化,结果发现,给药组中细胞开始变圆,漂浮细胞增多,部分聚集成团,高浓度给药组(>50 μmol/L)中有大量细胞碎片散在于培养液中,尤其是给药浓度达到100 μmol/L和200 μmol/L时大部分细胞已发生凋亡并裂解成碎片。

  2.2 MTT细胞活性

  不同浓度PPD处理HEK-293细胞24 h后,通过MTT染色方法检测细胞活性,见图2。由图2可见不同浓度的PPD对HEK-293细胞均有抑制作用,随着PPD浓度的升高, 对HEK-293细胞增殖的抑制率也逐渐升高,在0~200 μmol/L范围内呈剂量依赖。当PPD浓度达到100 μmol/L时抑制率已达77.1%,表明大部分细胞已死亡,这与细胞存活率检测结果相一致。应用SPSS 11.5PPC 软件作回归方程,计算PPD对肿瘤细胞作用24 h的IC50为21.8 μmol/L。

  2.3 细胞核染色质的形态

  不同浓度PPD处理HEK-293细胞24 h后,通过Hoechst 33258染色观察细胞核染色质的形态,见图3(封二)。HEK-293细胞的DNA在结合了Hoechst 33258后,紫外光激发时发射明显的蓝色荧光。PPD组的细胞核出现典型的凋亡形态学的改变,部分染色质出现浓缩状态,细胞核的染色质高度凝聚、边缘化,严重时甚至裂解为碎块,产生凋亡小体,而正常对照组的细胞没有出现明显的细胞核染色质的形态学改变。细胞核染色质的形态,随PPD浓度呈现一定的剂量相关性。当PPD浓度达到100 μmol/L时,大部分细胞发生凋亡,细胞核裂解为碎块,可观察到凋亡小体。

  2.4 细胞凋亡DNA片段化检测

  根据DNA Ladder抽提试剂盒说明提取不同浓度PPD处理的HEK-293细胞的DNA Ladder。取部分抽提得到的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳分析,见图4。结果显示不同浓度的PPD处理HEK-293细胞24 h,琼脂糖凝胶电泳均出现典型“梯形”DNA条带,且呈现一定的剂量相关性,证实PPD具有诱导HEK-293细胞凋亡的作用。尤其是当PPD浓度达到100 μmol/L时大部分细胞发生凋亡,电泳呈现非常明显DNA Ladder条带。

  3 讨 论

  二醇组人参皂苷20(S)-人参皂苷Rg3和Rh2抗肿瘤作用方面研究已有很多报道, 它们在抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤微血管密度、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移、对化疗药物减毒增效等方面具有较广泛的抗肿瘤功效[13-14]。这些皂苷本身并不能被胃肠道直接吸收,通过肠道菌的作用,转化为次生代谢物后方可吸收入血。将人参皂苷Rg3、Rh2上的葡萄糖水解得到的就是PPD,二醇组人参皂苷(如Rb1, Rb2, Rc等)经人肠道菌代谢微最终均转变为原人参二醇。PPD作为人参二醇组皂苷化学水解及人肠道菌代谢的最终产物, 有可能比人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2具有更强的抗癌活性、抗癌增效减毒作用以及增强机体免疫功能的作用, 而且生物利用度可能更高[15]。

  本研究表明PPD可显著抑制HEK-293细胞增殖并诱导其凋亡,当其浓度达到100 μmol/L时可有效诱导HEK-293细胞凋亡,为临床给药提供了参考依据。肿瘤的发生是多种因素作用的结果,PPD作为具有抗肿瘤作用的单体皂苷, 其抗肿瘤生长的作用机制可能与其诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移、清除肿瘤细胞和组织内的自由基、提高抗氧化水平、通过调控基因表达和信号传导通路来调控肿瘤细胞生长的作用有关。PPD可通过增强机体免疫力,促进肿瘤细胞凋亡而起到抑制肿瘤作用[2]。本研究表明PPD能明显地减少HEK-293细胞存活率,抑制细胞生长并诱发其凋亡, 并且呈现一定的剂量依赖关系,因此,推测PPD对HEK-293细胞的杀伤作用可能由于其对HEK-293细胞凋亡的诱导,为深入研究PPD的作用机制提供了基础。

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