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人参皂苷Rh2诱导人胃癌SGC27901 细胞凋亡的研究

2014-08-04

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导读:研究人参皂苷Rh2(G2Rh2)对人胃癌细胞SGC27901的影响。方法:采用MTT 法检测G2Rh2 对SGC27901 细胞存活率的影响。

人参皂苷Rh2 诱导人胃癌SGC27901 细胞凋亡的研究

李晶华,李杨,何侃,孔维,金英花

【摘要】 目的 研究人参皂苷Rh2 ( G2Rh2) 对人胃癌细胞SGC27901 的影响。方法 采用MTT 法检测G2Rh2 对SGC27901 细胞存活率的影响;流式细胞分析法检测凋亡小体的含量;免疫印迹技术及体外Caspase23/ 27 活力测定方法检测Caspase的激活状态。结果 G2Rh2 对SGC27901 细胞生长有明显的抑制作用,且呈量- 效关系, IC50为913μg/ ml 。715μg/ ml G2Rh2 作用SGC27901 细胞24 h ,凋亡细胞数量为6197 %。715μg/ ml G2Rh2 作用SGC27901 细胞20 h ,出现多聚(ADP2核糖) 聚合酶[poly(ADP2ribose) polymerase ,PARP]断裂,Caspase23/ 27 活力开始出现,并随作用时间的延长而增强。结论 G2Rh2 诱导Caspase 参与SGC27901 细胞凋亡。

【关键词】 人参皂苷Rh2 ;胃癌;SGS27901 细胞;凋亡

Induction of Apoptosis of Human Gastric Carcinoma SGC27901 Cells with Ginseno2side Rh2

LI Jing2hua △ ,LI Yang ,HE Kan ,et al ( △College of Life Science , Jilin University , Changchun 130021 , China)

【Abstract】 Objective  To study the effect of ginsenoside Rh2(G2Rh2) on human gastric carcinoma SGC27901 cells.Methods  Add G2Rh2 to SGC27901 cells to various final concentrations. Determine the survival rate of SGC27901 cells byMTTmethod ,the content of apoptotic body by flow cytometry ,and evaluate the activation of caspase by Western blot and determination of caspase23/ 27 activity in vitro. Results  GSRh2 showed significantly dose2dependent inhibitory effect on the growth of SGC27901 cells. The IC50 of G2Rh2 was 913μg/ ml. After treatment with 715 μg/ ml of G2Rh2 for 24 h ,the apoptosis rate of SGC27901 cells was 6197 %. Both the cleavage of poly(ADP2ribose) polymerase (PARP) and caspase23/ 27 activity appeared after treatment with 715μg/ ml of G2Rh2 for 20 h and increased as time goes on.Conclusion  GSRh2 induced the apoptosis of SGC27901 cells in which caspase was involved.

【Key words】 Ginsenoside2Rh2 ;Gastric carcinoma ;SGC27901 cells ;Apoptosis

G2Rh2 是一种由鲜人参加工制备红参时生成的次生苷。研究证实,G2Rh2 具有很强的抗肿瘤活性,能够诱导人肝癌细胞SK2HEP21 和人黑色素瘤细胞A3752S2 的凋亡[1 ,2 ] ,抑制人乳腺癌细胞MCF27 增殖[3 ] ,诱导人肝癌细胞SMMC27721 和人早幼粒细胞白血病细胞HL260 的分化[4 ,5 ] 。但目前关于G2Rh2对人胃癌细胞的作用研究较少。本文对G2Rh2 诱导伴有淋巴结转移的人胃癌细胞SGC27901 细胞凋亡的作用进行了研究,旨在为胃癌的治疗提供新的理论依据。

11 材料与方法

111  材料

人胃癌细胞株(SGC27901) 购自中国医学科学院基础医学研究所;辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体和MTT购自美国Sigma 公司;RPMI21640 培养基和小牛血清为美国GIBCOBRL 产品; G2Rh2 为大连生生绿谷生物工程有限公司产品;Caspase23/ 27 活力检测试剂盒购自Calbiochem 公司; 兔抗PARP 抗体购自Santa Cruz ; 多功能酶标仪TECAN GENios 为瑞士Tecan 公司产品。

112  细胞培养

将SGC27901 细胞培养于含有10 %小牛血清、100 IU/ ml青霉素和100 μg/ ml 链霉素的RPMI21640培养液中,在37 ℃,饱和湿度,5 % CO2 孵箱中培养。G2Rh2 用70 %乙醇溶解,乙醇在培养液中的终浓度均低于015 %。

113  G2Rh2 对SGC27901 细胞存活率的影响采用MTT 法[6 ] ,SGC27901 细胞以1 ×104 个/ 孔接种于96 孔培养板中,培养24 h 后,换成不含血清培养液,G2Rh2 终浓度分别为0、11875、3175 、715 和15μg / ml ,继续培养48 h ,在培养结束前4 h 掺入20μl MTT (5 mg/ ml) ,培养结束后,产生的紫色晶体用DMSO 溶解,在550 nm 波长下测定A 值,并计算半数抑制浓度IC50 。

114  G2Rh2 诱导SGC27901 细胞凋亡的检测取对数生长期SGC27901 细胞,以116 ×106 个接种于10 cm 培养皿中,培养24 h 后,加入终浓度分别为0 和715μg / ml 的G2Rh2 ,继续培养24 h ,收集细胞,并用70 %冰乙醇固定,碘化丙啶(PI) 染色30 min。用FACS Calibur 流式细胞仪检测,Modfit 软件分析,Sub2G1 细胞代表凋亡细胞。以未加G2Rh2 的细胞为对照。

115  免疫印迹分析

SGC27901 细胞用预冷的PBS(0101 mol/ L ,pH 714)洗1 次后,溶解于细胞裂解缓冲液(20 mmol/ L Tris ,pH 715 , 015 % Triton X2100 , 2 mmol/ L MgCl2 ,1 mmol/ L DTT , 1 mmol/ L EGTA , 50 mmol/ L β2glyc2erolphosphate , 25 mmol/ L NaF , 1 mmol/ L Na3VO4 ,2μg/ mlantipain , 1 mmol/ L phenylmethyl sulfonyl fluo2ride) 中,冰浴1 h ,4 ℃条件下,12 000 r/ min ,离心15 min。取上清,用BCA ( Pierce ,USA) 法定量蛋白质浓度。每个样品取50 μg 蛋白质, 进行SDS2PAGE后,电转移至PVDF 膜上。PVDF 膜用含5 %脱脂奶粉的封闭液封闭。以兔抗PARP 为检测抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体为二抗通过ECL (Amer2sham) 显色法分析PARP 是否断裂。

116  Caspase23/ 27 活力检测

多聚(ADP2核糖) 聚合酶[poly (ADP2ribose) poly2merase ,PARP]是Caspase23/ 27 已知的底物,通过检测PARP 是否被断裂, 可以判断G2Rh2 诱导的SGC27901 细胞凋亡过程中Caspase23/ 27 的激活状态。取715μg/ ml G2Rh2 分别作用SGC27901 细胞0、4、8、12 、16 、20 、24 h ,收集并裂解细胞,按试剂盒说明,细胞裂解液与底物DEVD2pNA 于37 ℃条件下孵育30 min ,以405 nm 为吸收波长,测定A 值。

21 结果

211  G2Rh2 对SGC27901 细胞存活率的影响采用MTT法测定SGC27901 细胞在不同浓度的G2Rh2 作用下存活率的变化。结果表明, G2Rh2 对SGC27901 细胞的生长有明显的抑制作用,3175 、715和15μg/ ml G2Rh2 作用组与对照组相比,差异有显著意义( t = 6174 ,27186 ,91109 , P < 0105) ,且呈量2效关系,见图1。IC50为913μg / ml 。212  G2Rh2 诱导SGC27901 细胞凋亡的检测采用流式细胞仪分析技术检测代表凋亡细胞的Sub2G1 细胞数量百分比,结果表明,715 μg / ml G2Rh2 作用SGC27901 细胞24 h , 凋亡细胞数量为6197 % ,而对照组仅有0140 %细胞凋亡,见图2。

图1  G2Rh2 对SGC27901 细胞生长的抑制作用

Fig 11 The inhibitory effect of G2Rh2 on SGC27901 cell vi2

ability

图2  G2Rh2 诱导SGC27901 细胞凋亡

Fig 21 Induction of apoptosis in SGC27901 cells

213  免疫印迹分析

检测结果表明,715 μg/ ml G2Rh2 作用于SGC27901 细胞20 h ,出现PARP 的断裂,处理24 h 时,

PARP 的断裂片段增多,见图3。

1~ 7 : SGC27901 cells 0 , 4 , 8 , 12 , 16 , 20 and 24 h after

treatment with G2Rh2 respectively.

图3  Western blot 检测PARP 的断裂Fig 31 Analysis of cleavage of PARP by Western blot

214  G2Rh2 激活Caspase23/ 27 的检测采用体外Caspase 活力测定方法检测Caspase23/ 27 的活力。结果表明,G2Rh2 作用于SGC27901 细胞20 h ,Caspase23/ 27 的活力开始出现,并且随作用时间的延长而增强,24 h 时,与对照组相比差异有显著意义( t = 5196 , P < 0105) ,见图4。表明G2Rh2 通过激活Caspase23/ 27 而诱导SGC27901 细胞凋亡。图4  Caspase23/ 7 活力检测Fig 41 Determination of activity of caspase23/ 7

31 讨论

G2Rh2 是从人参中提取的活性成分。大量研究表明,G2Rh2 具有很强的抗肿瘤作用,且抗肿瘤作用机理呈现多部位、多环节、多靶点的特点[6 ,7 ] 。同一药物对不同的细胞可能有截然不同的效果,因此,G2Rh2 对不同肿瘤细胞的作用及其机理的研究引起了人们的广泛关注。

细胞凋亡是由基因控制的一种自主的有序的细胞死亡。研究发现,化疗、放疗和免疫疗法对肿瘤细胞的抑制作用主要是通过诱导细胞凋亡来实现[7 ] ,因此,查明肿瘤细胞凋亡的确切分子机制,恢复肿瘤细胞的凋亡通路,是肿瘤治疗成功的有效途径。通过G2Rh2 对人胃癌细胞作用的研究,我们发现G2Rh2 能够诱导人胃癌细胞发生细胞调亡,并且Caspase 参与这种细胞凋亡过程。SGC27901 细胞是伴有淋巴结转移的人胃癌细胞,已经失去了正常的细胞凋亡功能。发现能够诱导SGC27901 细胞凋亡的药物,对于晚期胃癌的治疗具有重要的意义。

提高由DNFB 诱导的小鼠迟发型变态反应强度,有增强细胞免疫作用的功能;具有提高小鼠血清抗体水平及促进溶血空斑形成的作用,可增强小鼠的体液免疫功能;另外它在提高NK细胞的杀伤活力方面也有明显作用。依据卫生部《保健食品的功能学评价程序和检验方法》(2003 版) ,可判定新生牛肝活性肽具有增强免疫力的功能。非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分,单核2巨噬细胞吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一。在本次实验中,反应细胞吞噬能力的两项试验,即小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和小鼠碳廓清试验均未得到阳性结果,这可能与新生牛肝活性肽的给药剂量、给药周期及其结构与性质等因素有关。非特异性免疫是一种先天性免疫能力,遗传因素的影响也不容忽视。

参考文献

[1 ]LaBrecque DR ,Pesch LA. Preparation and partial characterization of hep2atic regeneratire stimulator substance (HSS) from rat liver. J Physiol ,1975 ,248(2) :2732384.

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参考文献

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[5 ]李罗丝,罗志勇,文斌,等. 人参皂苷Rh2 对白血病HL260 细胞凋亡的诱导作用. 中国现代医学杂志,2006 ,21(16) :3215~3217.

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[7 ] Young MH ,Jin HL ,Hye KN ,et al . Ginsenoside2Rh22Induced mitochon2 drial depolarization and apoptosis are associated with reactive oxygen species and Ca2 +2 mediated c2Jun NH22 terminal kinase 1 activation in HeLa cells. J Pharmacol Exp Ther ,2006 ,319 (3) :127621285.

[关键词: 人参皂苷Rh2 胃癌 ]

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