人参皂苷单体Rh2对小鼠前胃癌MFC细胞的增殖抑制作用

　　人参皂苷单体Rh2 对小鼠前胃癌MFC细胞的增殖抑制作用

　　吴歌, 杨世杰

　　(吉林大学基础医学院药理学教研室, 吉林长春130021)

　　[基金项目] 　吉林省科技厅基金资助课题(20040411)

　　[作者简介] 　吴　歌(1978 - ) , 女, 吉林省长春市人, 在读医学博士, 主要从事肿瘤药理学研究。

　　出处：第34 卷　第1 期 吉　林　大　学　学　报　( 医　学　版)

　　[摘　要] 　目的: 探讨Ginseng Rh2 ( G2Rh2 ) 对小鼠前胃癌MFC 细胞的增殖抑制作用及其机制。方法: MFC细胞(密度为110 ×109 ·L - 1 ) 分为空白组、G2Rh2 组(3 、10 、30 mg ·L - 1 ) 组, MTT 法检测MFC 细胞活性; 流式细胞仪检测细胞周期; 流式细胞仪和免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白cyclin D1 、细胞周期依赖激酶(CDK) 抑制蛋白p27kip1 在MFC 细胞中的定性和定量表达。结果: 与相应空白组比较, G2Rh2 ( 3 、10 、30 mg ·L - 1 ) 组在1 、2 和4 h 细胞增殖活性随着剂量和时间增加而逐渐下降( P < 0105 或P < 0101) ; 与空白组比较, 各药物处理组G0 / G1 期细胞比率随着剂量增加而上升( P < 0105 或P < 0101) , 同时细胞周期蛋白cyclinD1 含量逐渐降低( P < 0105 或P < 0101) , 细胞周期抑制蛋白p27kip1 含量逐渐升高( P < 0105 或P < 0101) 。

　　结论: 人参皂苷单体G2Rh2 可抑制MFC 细胞增殖, 可使MFC 细胞周期阻滞在G0 / G1 期而抑制细胞活性, 这一过程可能与p27kip1升高、细胞周期蛋白cyclin D1 含量降低有关。

　　[关键词] 　人参皂苷单体Rh2 ; MFC 细胞; 细胞周期

　　[中图分类号] 　R329128 ; R73512 　　[文献标识码] 　A

　　Anti2proliferation effect of Ginseng Rh2 on MFC cells

　　WU Ge , YANG Shi2J ie

　　(Department of Pharmacology , School of Basic Medical Sciences , J ilin University , Changchun 130021 , China)

　　Abstract : Objective 　To investigate the anti2proliferation effect of Ginseng Rh2 ( G2Rh2 ) on mouse MFC gastric cells and it s mechanism. Methods 　MFC cells (110 ×109 ·L - 1 ) were divided into four gourps : cont rol group and G2Rh2 (3 , 10 , 30 mg ·L - 1 ) groups. The cell viability was determined by MTT ; the cell cycle was detected by flow cytomet ry ; the protein expression of cyclin D1 and p27kip1 were observed respectively by qualitative and quantitative analysis. Re sults 　Compared with cont rol group , the cell viabilities decreased gradually with the increasing of dose and time in G2Rh2 (3 , 10 , 30 mg ·L - 1 ) groups at different time (1 , 2 , 4 h) ( P < 0105 or P < 0101) , the ratio ofVCM G0 / G1 cells increased in a dose2dependent manner ( P < 0105 or P < 0101) , at the same time , the expression level of cell cycle protein cyclin D1 decreased ( P < 0105 or P < 0101) , and the expression level of p27kip1 increased ( P < 0105 or P < 0101) . Conclusion 　G2Rh2 can decease cell viability by inducing apoptosis and arresting cell cycle , and the process may associate with p27kip1 increase and cyclin D1 decrease.

　　Key words : Ginseng Rh2 ; MFC cells ; cell cycle

　　人参皂苷单体Rh2 ( Ginseng Rh2 , G2Rh2 )是从红参参根中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体, 各国研究者已在一些肿瘤细胞体外培养系中[125 ] 观察到G2Rh2 对肿瘤细胞的增殖抑制作用,并初步揭示该过程与诱导细胞调亡、分化及阻滞细胞周期有关。而关于G2Rh2 对胃癌细胞增殖抑制和相关分子机制尚未见报道。本研究拟以小鼠前胃癌细胞株MFC 为研究对象, 观察不同浓度G2Rh2对胃癌细胞周期阻滞的作用, 并初步探讨相关的分子机制。

　　1 　材料与方法

　　1.1　药品及试剂　G2Rh2 由吉林大学分析化学教研室提供, 由011 %DMSO 溶解成600 mg ·L - 1 的母液, 使用时稀释到所需的终浓度; IMDM 培养基购自美国Gibco 公司; 新生小牛血清购自杭州四季清生物有限公司; PI 购自Sigma 公司; Rnase购自北京鼎国生物公司; 小鼠抗兔cyclin D1 和p27kip1 购自Santa Cruz 公司; FITC 标记山羊抗小鼠IgG盒购自中杉金桥; 辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 购自中杉金桥; Triton2100 购自上海生工;DAB 购自福州迈新。

　　1.2　细胞来源及培养　MFC 细胞由本室冻存, 经常规复苏后培养和维持在体积分数为10 %新生牛血清IMDM 培养液里, 置CO2 培养箱( 37 ℃,5 %CO2 ) 培养, 取对数生长期细胞经24 h 无血清培养后, 分组进行实验。

　　1.3　分组及给药　MFC 细胞( 密度为110 ×109 ·L - 1 ) 按设计要求分为空白组、G2Rh2 组(3 、10 、30 mg ·L - 1 ) 组, 检测细胞活性、细胞周期和cyclin D1 及p27kip1表达。

　　1.4 MTT 法检测细胞活性　收获各组细胞, 每组5 复孔, 每孔190μL 接种于96 孔培养板内, 分别经用无血清和10 %小牛血清中培养24 h 后加入G2Rh2 , 继续培养1 、2 和4 h , 培养结束前每孔加入10μL MTT (5 g ·L - 1 ) , 待形成蓝紫色甲瓒后, 吸弃孔中上清液, 加入100 μL DMSO , 充分振荡溶解结晶, 用酶联免疫检测仪( SunriseRemote , Aust ralia) 于570 nm 波长处测其吸光度A 值( A 值与细胞活性成正比) , 各重复3 次独立实验。

　　1.5 流式细胞仪分析细胞周期　收集细胞, 用70 %乙醇4 ℃固定过夜, 400μL PBS 漂洗3 次, 用含50 mg · L - 1 Rnase 、011 % Triton2100 、50 mg ·L - 1 PI 的荧光染色液对细胞进行染色, 避光37 ℃孵育30 min , 流式细胞仪(FACS) 分析细胞周期。

　　1.6　流式细胞仪分析cyclin D1 和p27kip1 在细胞中的表达　收集细胞, 用70 %乙醇4 ℃固定过夜,400μL PBS 漂洗3 次, 011 % Triton2100 室温孵育1 5 min , 1 %BSA 室温孵育2 h , 加入小鼠抗兔cyclin D1 和p27kip1 抗体(1 ∶200) 100 μL , 4 ℃孵育过夜, 加FITC 标记的羊抗小鼠IgG (1 ∶50)100μL , 避光37 ℃ 孵育45 min , 每步用400 μLPBS 漂洗3 次, 流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。以未加小鼠抗兔cyclin D1 和p27kip1 抗体的样品作为阴性对照, 每个样品实际测得的平均荧光强度减去阴性对照的平均荧光强度, 即为抗原的相对表达水平。

　　117 　免疫细胞化学法分析cyclin D1 和p27kip1 在细胞中的表达

　　收集细胞, 将细胞涂布于预先用多聚赖氨酸包被的载玻片上, 4 %多聚甲醛固定

　　10 min , 水化10 min , 013 % TritonX2100 作用15 min ; 0101mol ·L - 1 PBS 冲洗3 次, 每次5 min ;按免疫组化试剂盒操作说明书进行染色; 滴加DAB , 室温避光显色15～20 s , 水终止反应, 苏木素染核, 1 %盐酸酒精分化, 蒸馏水返蓝, 梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明, 中性树胶封固, 镜下观察结果并拍照。结果采用image2protein plus 统计软件进行处理, 每张照片选择5 个不重复染色阳性高密区, 计算蛋白表达棕黄色阳性区域平均光密度( IOD/ Area) 。

　　1.8　统计学处理　采用SPSS 1010 统计软件, 组间平均光密度比较采用t 检验, 组内比较采用方差分析。

　　2 　结　果

　　2.1　MFC 细胞活性　G2Rh2 各组无血清培养MFC 细胞活性明显降低, 与对照组比较差异有显著性( P < 0101 , 见图1) , 且存在明显的剂量和时间依赖性。而G2Rh2 各组10 %小牛血清培养后的MFC 细胞活性与对照组比较差异无显著性( P >0105) 。

　　2.2　MFC 细胞周期　对照组G0 / G1 期细胞占28156 % , G2Rh2 各组G0 / G1 期细胞比率分别为37174 %、77199 %和79129 % , 与对照组比较明显上升( P < 0101) , 且呈明显的剂量依赖性(见图2) ; G2 / M、S 期细胞比率与对照组比较显著下降( P < 0101) 。

　　213 　流式细胞仪检测结果　与对照组比较,G2Rh2 各组cyclin D1 含量呈剂量依赖性下降( P <0105 或P < 0101) , 而p27kip1 含量呈剂量依赖性升高( P < 0105 或P < 0101) , 见表1 。

　　表1 　流式细胞仪检测MFC 细胞cyclin D1 and p27kip1结果

　　Tab11 　Effect of G2Rh2 on cyclin D1 and p27kip1 of MFC

　　cells by flow cytomet ry ( n = 5 , x ±s)

　　Group Cyclin D1 p27kip1

　　Cont rol 3157 ±256 1714 ±160

　　G2Rh2 3 mg ·L - 1 2757 ±210 3 2212 ±193 33

　　10 mg ·L - 1 2102 ±198 33 2503 ±219 33

　　30 mg ·L - 1 1894 ±165 33 3102 ±287 33

　　3

　　P < 01 05 , 33

　　P < 01 01 vs cont rol group

　　2.4　免疫细胞化学　cyclin D1 棕黄色阳性区域多在胞核, 而胞质亦有少量表达, 与对照组比较, 随用药剂量增加, G2Rh2 组平均光密度值逐渐下降( P < 0105) ; 而p27kip1 在胞核、胞质中亦均有表达, 其平均光密度随剂量增加而升高( P < 0105) 。

　　3 　讨　论

　　人参皂苷是人参的主要活性成分, 在人参皂苷单体中Rh2 的抑瘤活性最强, 体内外实验结果表明, G2Rh2 可以时间和剂量依赖性方式抑制宫颈癌[1 ] 、肝癌[2] 、脑胶质瘤[3 ] 、肺癌[4 ] 等多种肿瘤细胞的增殖, 且其诱导凋亡与抑制增殖作用呈正相关, 但目前尚无G2Rh2 对胃癌增殖抑制作用的研究报道。

　　研究发现, G2Rh2 对无血清培养后的MFC细胞的生长抑制作用亦具有时间和剂量依赖性, 而对10 %血清培养后的MFC 细胞无明显抑制作用,提示该药的血浆蛋白结合率较高, 这与费晓方等[ 6 ]的报道一致。

　　细胞周期调控异常是肿瘤发生发展过程中最重要的事件之一, 可使细胞生长失控和不分化, 并最终导致肿瘤的发生, 而通过对细胞周期的有序调控可以达到抑制肿瘤增殖的目的[7 ,8 ] 。本研究结果显示, G2Rh2 对MFC 细胞周期的影响, 随着G2Rh2剂量增加, MFC 细胞的G0 / G1 期细胞比率逐渐上升, 而G2 / M 期细胞比率逐渐下降, 说明G2Rh2亦可通过G0 / G1 期阻滞作用抑制MFC 细胞的增殖作用, 进而诱导细胞凋亡。G0 / G1 期是细胞周期进程中关键检查点, 细胞周期进程的调节依赖一系列调控因子的有序聚合和激活, 其中G0 / G1 周期相关蛋白cyclin D 是与肿瘤发生、发展关系最密切的细胞周期蛋白之一, 其在多种肿瘤组织中均有过度表达[9 ] , 致癌作用主要表现在协同CDK 对Rb 蛋白磷酸化。周期抑制激酶抑制因子p27kip1 为非特异性G0 / G1 期负调控蛋白, 其低表达或缺失与多种癌症的发生和发展有关[10 ] , 可抑制cyclinA2CDK2 、cyclinE2CDK2 和cyclinB12CDK2 等多种蛋白酶的活性而控制细胞周期G12S 的转换。以上研

　　究均提示, 抑制cyclin D/ CDK、提高p27kip1 的活性是一种治疗癌症有价值的方法。为进一步研究G2Rh2 影响MFC 细胞周期进程的分子机制, 本研究观察了cyclin D1 和p27kip1 的表达情况, 流式细胞仪和免疫细胞化学法的定性和定量检测表明,G2Rh2 用药后能显著降低细胞内周期蛋白cyclin D1的水平, 同时可激活MFC 细胞中CD K 抑制蛋白p27kip1 表达, 这与G2Rh2 最终引起MFC 细胞在G0 / G1 期积累的结果一致, 提示G2Rh2 阻滞细胞于G0 / G1 期可能主要是通过直接抑制cyclin D1 的活性以及增加p27kip1 的表达, 进而特异性地抑制cyclin D1 / CDK4 、cyclin D1 / CD K6 、cyclinE/ CDK2 等酶的活性而实现的。G2Rh2 对胃癌细胞增殖抑制更深入的分子机制还有待于进一步研究。

　　[参考文献]

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