HPLC法测定酶转化生产人参皂苷Rh2 的含量
导读:用HPLC法测定酶转化法生产人参皂苷Rh2 的含量,以C18反相柱,乙腈-水(1∶1)为流动相,紫外检测波长203nm。
HPLC法测定酶转化生产人参皂苷Rh2 的含量
摘 要:用HPLC法测定酶转化法生产人参皂苷Rh2 的含量,以C18反相柱,乙腈-水(1∶1)为流动相,紫外检测波长203nm。该法线性关系良好,平均回收率为98.4%,平均标准偏差(RSD)为1. 79%,达到了药典规定。在该色谱条件下,人参皂苷Rh2的保留时间22~24min,人参皂苷Rh2的R型和S型的含量比例为6∶4, R型保留时间为24min,S型保留时间为22min,R型在S型后面出峰。
关键词:HPLC;酶转化;人参皂苷Rh2
人参的主要有效成分为人参皂苷,生理活性极其广泛。其中人参皂苷Rh2 是一种抗肿瘤天然植物成分,是配合放疗、化疗增效减毒的首选药物。人参皂苷Rh2属微量成分,仅占总皂苷含量的万分之二。金凤燮等研究了能水解皂甙β- 糖苷键的酶性质,利用酶转化法,用人参中含量较高的皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd生产稀有皂苷Rh2 获得成功,现大连生生绿谷生物工程公司已投产。作者在查阅文献时发现,目前运用高效液相色谱法测定人参皂苷含量主要限于Rb1、Re、Rg1等,本文利用HPLC法测定酶转化产品Rh2 的含量,结果准确可靠,可作为控制本品质量的指标。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
高效液相色谱分析仪:Waters Model 510,Waters 490 Programmable Mutiwavelength De2tector,Waters 740 Data Module;色谱柱:Hypersil (R) ODS2反相柱,柱规格:250×4. 6mm,填料:ODS4μ;N2000数据工作站(浙江大学)进行电脑数据处理。
1. 2 药品与试剂
人参皂苷Rh2试品由大连生生绿谷生物工程公司提供,人参皂甙Rh2标准品由金凤燮教授提供,甲醇、乙腈为色谱纯试剂。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液
精密称取人参皂苷Rh2对照品10mg,以甲醇溶解并定容至10mL,摇匀,每1mL含人参皂苷Rh2为1mg。
2. 2 色谱条件
色谱柱为ThermoHypersil ODS2 (250×4. 5mm,5μm) ,流动相为乙腈- 水(1∶1) ,柱温为常温,流速1mL/ min ,进样量为10μL,检测波长为203nm,理论塔板数按20(R) - 人参皂苷Rh2峰计算应不低于3300,分离度大于1.5,回收率大于95%, RSD小于2%。在该色谱条件下,人参皂苷Rh2的S型和R型的保留时间分别为22min和24min。
2.3 供试品制备
取人参二醇类皂苷18. 3g,经酶解得到以人参皂苷Rh2为主的皂苷10. 65g,经硅胶柱分离提纯得到TLC单点的人参皂苷Rh2约3g。称取分离后的人参皂苷Rh2 10mg,用10mL甲醇超声振荡溶解,3500r/ min离心10min。
2.4 系统适用性实验
测得人参皂苷Rh2对照品及供试品的高效液相色谱,计算理论塔板数为3500。供试品色谱图中,人参皂苷Rh2峰与相邻杂峰分离完全、清晰,分离度大于1. 5,符合药典规定。
2.5 标准曲线的制备
精密称取人参皂苷Rh2对照品10mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别吸取此溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、17μL、20μL,注入液相色谱仪,按上述条件测定,以峰面积积分值为纵坐标,人参皂苷Rh2 的进样量为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为y=ax+b, a=2. 09E+005,b=4. 04E+003 ,相关系数r =0. 9946,表明本法在2μL/ mL~20μL/ mL浓度范围内有良好的线性关系。标准曲线如图1所示。
2. 6 稳定性实验
取同一批、按“供试品制备”项下方法处理得供试液,用外标含量测定方法测定,分别0h、4h、24h、48h进样,记录色谱峰面积,结果见表1。
如表1所示,该法RSD为1. 36%,在48h内供试品溶液中人参皂苷Rh2含量基本稳定。
2. 7 精密度实验
精密吸取同一批、按“供试品制备”项下方法处理得供试液,进样分析,记录色谱峰面积,重复5次,记录色谱峰积分值,结果见表2。
如表2所示,该法RSD值为1. 83%,表明本法具有较好的精密度。
2. 8 重现性实验
取同一供试品,独立测定5次,结果见表3。
如表3所示,该法RSD值为1. 75%,表明本法具有较好的重现性。
2. 9 加样回收率试验
精密量取已测知含量的供试品溶液3mL,精密加入人参皂苷Rh2对照品3mL,摇匀,进样分析,计算回收率,结果见表4。
如表4所示,本法平均回收率为98. 40%, RSD为1. 79%,表明本法准确度较高。
2. 10 样品测定
取人参二醇类皂苷,经酶解得到人参皂苷Rh2,经硅胶柱分离提纯得到TLC单点含量约为90%的人参皂苷Rh2产品各3批,按“供试品制备”项下方法制得供试液,进样分析,记录色谱峰面积,结果见表5。
如表5所示,经酶解和硅胶柱法分离的人参皂苷Rh2平均含量为90. 30%。
3 结 论
本研究突破了以前的TLC(即薄层色谱法)测定人参皂苷Rh2 含量的方法,用高效液相色
谱法测定人参皂苷Rh2的准确含量。色谱测定条件为流动相乙腈- 水(1∶1) ,流速1mL/ min,
UV203nm,色谱柱ThemoHypersil ODS2(250×4. 5mm,5μm) ,柱温为室温,理论塔板数不低
于3300,分离度应大于1. 5,回收率大于95%, RSD小于2. 0%, 达到了药典规定。经酶解并
经硅胶柱法分离的人参皂苷Rh2平均含量为90. 30%。人参皂苷Rh2中R型和S型的比例为6∶4。在该色谱条件下,人参皂苷Rh2的R型保留时间为24min左右,S型保留时间为22min
左右,R型在S型后面出峰。
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