RP-HPLC测定西洋参叶皂苷碱降解物中20(S)-人参皂苷Rh2的含量

　　[摘要]目的: 对西洋参叶皂苷碱降解物中20(S)-人参皂苷Rh2进行含量测定。方法: 采用RP-HPLC, ZORBAXEXTEND C18柱( 4.6 mm. 250 mm, 5μm) , 流动相甲醇-水( 85:15) , 流速1.2 mL・min- 1, 检测波长203 nm, 柱温25 ℃。结果: 20(S)-人参皂苷Rh2的进样量在0.5~ 25μg 有良好的线性关系, r = 0.999 9; 平均加样回收率为99.7%,RSD1.0%。结论: 该方法测定20(S)-人参皂苷Rh2简便快捷, 准确度高, 测定结果证实该降解方法20(S)-人参皂苷Rh2的转化率高。

　　[关键词]西洋参叶皂苷; 降解物; 20(S)-人参皂苷Rh2 ; RP-HPLC

　　人参皂苷作为人参属植物中的主要成分具有多方面的药理活性, 而一些人参二醇组的次级皂苷如20(S)-人参皂苷Rh2 具有更强的药理活性, 尤其在抗癌活性方面。研究表明西洋参茎叶皂苷中人参二醇组皂苷的含量高于人参三醇组皂苷, 因此采用降解法可以制备20( S)-人参皂苷Rh2。目前所报道的人参皂苷降解方法有酸降解、高温高压碱降解及酶降解, 这些方法均可用来制备包括20(S)-人参皂苷Rh2 在内的次级人参皂苷, 不过这些方法对制备20(S)-人参皂苷Rh2 的转化率各异, 最高转化率为4.1% 。为了得到具有天然构型而且活性高的20(S) -人参皂苷Rh2 并提高其得率, 利用高沸点有机溶剂及碱在高温条件降解西洋参叶皂苷,制备并分离得到了20(S)-人参皂苷Rh2。为考察20(S)-人参皂苷Rh2的制备工艺及测定所得20(S)-人参皂苷Rh2的纯度, 对西洋参叶皂苷碱降解物中20(S)-人参皂苷Rh2 的含量测定方法进行了系统研究。

　　1仪器、试剂及样品

　　1.1仪器与试剂

　　Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪, Agilent 1100工作站。甲醇为色谱纯( 天津四友生物医学技术有限公司) , 水为2 次蒸馏水。

　　1.2 供试品

　　1.2.1原料

　　本实验所用的原料为西洋参茎叶总皂苷, 购自吉林省靖宇县西洋参集团华洋制药厂, 产品中人参总皂苷含量在80% 以上。

　　1.2.2碱降解方法

　　取10g NaOH 和100mL甘油放入500 mL 不锈钢反应器中, 搅拌加入西洋参叶总皂苷5.0 g, 继续升温至210℃, 反应30 min, 将反应液趁热倾入200mL 冷水中, 放冷至室温, 减压抽滤,水洗沉淀至水洗液接近中性, 105℃减压( 真空度≦2.60 kPa)干燥2 h, 研细, 得碱降解产物约4.1 g。

　　1.3 对照品

　　20(S)-人参皂苷Rh2 为自制, 经过元素分析、MS,H-NMR,C-NMR, IR 等数据分析并与文献数据对比可确认该化合物结构。按本色谱条件,HPLC 归一化法分析测定纯度为99.2%。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　ZORBAX EXTENT C18 柱( 4.6 mm×250 mm, 5μm) , 流动相甲醇-水( 85:15) , 流速1.2 mL・min- 1, 检测波长203 nm, 柱温25 ℃ 。

　　2.2方法学考察

　　2.2.1流动相选择

　　20(S)-人参皂苷Rh2 的ODS薄层色谱试验结果表明, 以乙腈-水、甲醇-水作为流动相, 均可获得较好的分离效果, 为了降低检测成本, 决定选择甲醇-水作为流动相。另外为了缩短保留时间以便缩短检测时间, 在满足分离度的前提下尽量增加甲醇比例, 结果当甲醇-水为85:15 时分离度( 1.62) 、理论塔板数( 5 200) 、拖尾因子( 1.02) 等均符合规定要求, 而水的含量低于15% 时则分离度、理论板数、拖尾因子等不能满足有关规定。当以甲醇-水( 85:15) 为流动相, 流速为1.2 mL・min- 1, 柱温为25 ℃ 时, 20(S)-人参皂苷Rh2的保留时间为12.16min。当向样品中加入20(S)-人参皂苷Rh2 对照品后, 样品色谱图中12.16 min 峰的峰高增加, 但半峰宽不变, 由此可确定样品中12.16 min 的峰为20(S)-人参皂苷Rh2单一组分峰。因此决定以甲醇-水(85:15) 作为流动相。溶剂、标准品和供试品溶液HPLC 分离图谱见图1~ 3。

　　2.2.2线性关系的考察

　　取20(S)-人参皂苷Rh2对照品适量, 精密称定(125.20mg) ,置25mL 量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度, 制成5.008 mg・mL- 1的溶液。精密量取该溶液适量, 分别稀释成含量约为0.05, 0.10, 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5,2.0, 2.5 mg・mL- 1的对照溶液, 分别取10μL, 注入液相色谱仪( 测定条件同1) , 平行3 次, 考察峰面积平均值与进样量的线性关系。结果表明, 在0.5~25μg 进样量与峰面积呈线性关系。其回归方程Y= 247.49X - 13.67, r = 0.999 9。

　　2.2.3精密度试验

　　取0.5 mg・mL- 1 的20(S)-人参皂苷Rh2对照品溶液, 每次进样10μL, 平行进样5次, 峰面积的RSD0.40% 。

　　2.2.4 重复性试验

　　取碱降解产物, 精密称定5份, 均配制成2.0 mg・mL- 1的溶液, 依次进样10μL进行分析测定西洋参叶降解物中20(S)-人参皂苷Rh2含量的RSD 0.37% 。

　　2.2.5 加样回收率试验

　　20(S)-Rh2对照品( 纯度99.2%) 适量, 精密称定( 24.5 mg) , 放入100 mL 量瓶中, 配制成对照溶液( 0.243 mg・mL- 1) 。另取西洋参叶皂苷碱降解产物( 含量12.2%) 样品5 份, 每份约25 mg, 精密称定后, 放入25.0 mL 量瓶中, 各加入对照品溶液12.5 mL, 加甲醇溶解定容至刻度, 按含量测定方法测定, 计算回收率, 测得平均回收率为99.7%, 其RSD 1.0% 。

　　2.2.6稳定性试验

　　取2.0 mg・mL- 1的碱降解产物甲醇溶液, 在0~ 12 h 内每隔2 h 进样1 次, 进样量均为10μL, 测定峰面积, 结果RSD 0.86% , 可见在12 h 内稳定性良好。

　　2.3 样品测定

　　2.3.1 对照品溶液制备

　　取20(S)-人参皂苷Rh2对照品适量, 精密称定50.0 mg, 置10 mL 量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取上述溶液各1.0mL 置于10.0 mL 量瓶中, 用甲醇定容至刻线, 摇匀即得。

　　2.3.2供试品溶液制备

　　取碱降解产物约50.0mg, 精密称定, 以甲醇溶解并定容至25.0 mL 的量瓶中, 用0.20 μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液作供试液。

　　2.3.3 结果

　　对3 批西洋参叶皂苷碱降解物( 按1.2.2 方法制得) 测定, 以外标计算降解物中20(S) -人参皂苷Rh2的含量分别为12.2% , 12.8%, 13.1%,平均含量为12.7%。

　　3 讨论

　　3.1测定波长的选择的依据是20(S)-人参皂苷Rh2的紫外光谱显示在203 nm 附近有最大吸收, 这与其他达玛烷型人参皂苷的最大吸收波长相同, 故选定203 nm 为测定波长。

　　3.2 利用HPLC 测定西洋参茎叶总皂苷降解物中20(S)-人参皂苷Rh2的含量的文献已有报道, 但文中没有指出样品是通过什么降解方法而得到的。由于不同的降解方法得到的降解物中成分及其组成不同, 因此HPLC 的测定条件也存在差异。上述文献报道的HLPC 条件为: 流动相甲醇-水-磷酸( 87:13:0.2) , 流速0.8 mL・min- 1, 柱温40 ℃ 。重复上述HPLC 条件测定本降解物中20(S)-人参皂苷Rh2 发现, 其测定方法线性范围窄(仅0.6~ 6μg ) , 分离效果不理想( R < 1.5) , 流动相组成复杂、主峰保留时间长( > 19 min) , 操作费时。采用本实验的HPLC 条件可使测定的线性范围达到0.5~ 25.0μg, 分离度大于1.5, 流动相组成简单、保留时间短( 约12min) ,操作便捷、省时、准确。因此有必要对已有的测定方法进行改进。

　　3.3采用本方法对西洋参叶皂苷碱降解物中20(S)-人参皂苷Rh2 的含量测定结果表明, 本降解方法所得降解物中20( S) -人参皂苷Rh2的平均含量为12.7%, 按西洋参叶总皂苷计20(S)-人参皂苷Rh2的转化率为10.4%, 这与以往文献报道的降解方法(高温高压降解西洋参二醇组皂苷其转化率为4.1%; 酶解法降解原人参二醇组皂苷其转化率仅为0.42%) 相比, 提高了20(S)-人参皂苷Rh2的转化率和得率。

　　3.4本测定方法准确、可靠、便捷, 该方法及其测定结果可为20(S)-人参皂苷Rh2的制备和西洋参资源的开发利用提供科学的依据。