人参皂苷Rh2含量测定方法及药理作用研究现状

　　人参是五加科人参属植物,是传统的名贵药材.近年来,众多学者报道了人参单体的药理作用,特别是抗肿瘤作用,而研究发现人参中的抗肿瘤有效成分主要为人参多糖和人参皂苷.随着对人参研究的深入,日本学者首次从红参(人参经蒸制、烘干后得到的制成品) 中发现了人参皂苷Rh2 .这种皂苷是次生苷,是加入过程中由某些二醇组皂苷受热降解后生成的.金凤燮等报道了酶转化法生产Rh2 等人参稀有皂苷,提取效果较传统方法提高了500～700倍,实现了工业化生产,为Rh2 的实际应用提供了可行性.本文对人参皂苷Rh2 含量的测定方法及药理作用进行了综述.

　　1 Rh2 含量测定方法

　　蒋磊等报道,采用HPLC 法测定Rh2 准确含量,其测定条件中流动相为甲醇-乙腈-水为8 ∶8 ∶1 ,流动速度为1 mL/ min ,紫外检测波长为203 nm ,色谱柱为Thermo Hypersil ODS 2 (25010 mm ×415 mm , 510 μm) , 柱温为室温, 回收率高于99.74 % ,RSD 小于11.83 %,达到了药典规定.在该色谱条件下,人参皂苷Rh2 的保留时间均为8～10min ,并确定了人参皂苷Rh2 的R 型和S 型含量的高效液相色谱条件为Thermo Hypersil ODS 2( 25010 mm ×415 mm , 510μm) 色谱柱,流动相为乙腈-水为1 ∶1 , 柱温为室温, 流动速度为1 mL/ min ,进样量为10μL ,检测波长为203 nm ,理论塔板数按人参皂苷Rh2 峰计算应不低于3 700 ,分离度应大于115 ,得人参皂苷Rh2 中R 型与S 型之比为6 ∶4 ,在该色谱条件下,人参皂甙Rh2 的R 型保留时间均为17 min , S 型保留时间均为16 min ,R 型在S 型之后出峰.冯林等报道,采用反相高效液相色谱法测定人参Rh2 的含量,测定条件中色谱柱为ODS-C18 (25010 mm ×416 mm ,51μm) ,流动相为乙腈-水(60 ∶40) ,流动速度为1.0 mL/ min ,检测波长为203 nm ,柱温为30 ℃,结果表明人参皂苷Rh2 质量浓度在80～240 mg/L 范围内时进样量与峰面积呈良好的线性关系, r = 0.999 2 ,平均回收率为99.75 % (n = 6)。顾轶等报道,采用LC-MS法测定Beagle 犬血浆中人参皂苷2 0 ( R)-Rh2 的含量, 检测条件色谱柱为Cosmosil ODS 柱(15010 mm ×210 mm i.d.,5μm ,Nacalai Tesque ,日本) , 外加1 个C18 柱( Security Guard , Phenomenex ,美国) , 柱温为40 ℃, 流动相为乙腈及500μmol/ L 氯化铵水溶液, 流动速度为0.2 mL/ min , 梯度为乙腈40 mL/ L (0 min) , 乙腈60 mL/ L (0.03 min) ,乙腈80 mL/ L (5.00 min) ,乙腈95 mL/ L (5.03 min) ,乙腈99 mL/ L (7.00 min) ,乙腈40 mL/ L (7.50 min) , Pump Stop (9.50 min) .质谱检测条件中离子化方式为电喷雾( ESI) ,检测模式为选择性离子检测(SIM) ,检测离子为负离子,20 (R)-Rh2 的m/ z 为657.35 ,洋地黄毒苷m/ z 为799.55 ,雾化气流动速度为1.5 L/ min ,反吹气压力为1 MPa ,曲形脱溶剂装置温度为250 ℃,电压为-5 V ,加热块温度为200 ℃,离子源温度为250 ℃,电压为- 4.5 kV ,四级杆流电压为0 V ,交流电压为150 V ,检测电压为1.6 kV.取具塞离心管数只,各加入Beagle 犬空白血浆1 mL ,精密加入不同质量浓度的20 (R)-Rh2 标准品溶液10μL ,分别制备成含20 ( R)-Rh2 质量浓度为0.5 , 1.0 , 5.0 , 10.0 ,50.0 ,100.0 ,200.0μg/ L的溶液,按上述血浆样品处理方法进行操作测定.样品峰面积与内标峰面积的比值( Y) 及对血药质量浓度( c ) 作线性回归,得标准曲线回归方程( n = 6 ) 为Y = 0.024 4 c + 0.008 8( r = 0.999 8 ) .按上述方法测得20 ( R)-Rh2 在Beagle 犬血浆中最低定量限为0.5μg/ L (信号噪声比大于10 ) , 相对标准偏差( RSD) 为17.7 %(n = 6) ,符合FDA 对生物样本LLOQ 的要求.方亮等报道,采用大孔吸附树脂法测定梅花参芪精中人参皂苷含量, 此法回收率为94.58 % , RSD 为1.54 %.

　　2 药理作用

　　2.1 抗肿瘤作用

　　人参皂苷的抗肿瘤作用已备受关注,特别是Rh2 对多种癌细胞的直接杀伤作用.已发现的作用机制有调节肿瘤细胞信号通路系统,影响细胞端粒酶的活性,阻断肿瘤细胞重要成分的合成与代谢,逆转肿瘤细胞的异常分化及耐药性,增强机体免疫力,提高抗肿瘤能力.

　　2.1.1对黑色素B16细胞具有明显的分化诱导作用

　　体外实验证明,10 mg/ L 人参皂甙Rh2 可明显抑制黑色素B16细胞的生长,并呈现质量浓度依赖性,IC50 为4.1 mg/ L ;对B16 细胞有较强的分化诱导作用,表现为黑色素生成能力明显增强,形态向上皮样细胞分化,黑色素颗粒增多,生长变缓慢.细胞动力学研究结果表明,Rh2 可使黑色素B16 细胞阻断在G1 期,亦提示Rh2 对B16细胞具有分化诱导作用.

　　2.1.2 C6 胶质瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用

　　2 ,4 ,8μmol/ L 人参皂苷Rh2 对C6 胶质瘤细胞均有抑制增殖作用, 且呈现出明显的量效关系;4μmol/ L人参皂苷Rh2 作用72 h 后,对C6 胶质瘤细胞诱导凋亡作用最为明显; 人参皂苷Rh2 作用后,处于G0 / G1 期细胞百分率明显下降, 而处于S 期细胞百分率则显著增高 .

　　2.1.3对食管癌Eca2109 细胞周期的影响

　　研究结果表明,人参皂苷Rh2 对Eca-109 细胞的生长具有抑制作用,并呈剂量及时间依赖性.人参皂苷Rh2可将人食管癌Eca-109 细胞阻滞于G0 / G1 期,诱导肿瘤细胞分化, 并通过影响细胞周期调控因子cy-clinE ,CDK2 ,p 21WAF 1 基因的表达来抑制食管癌细胞的增殖.

　　2.1.4 对前列腺癌细胞株PC-3 M 移行周期的影响

　　可使PC-3 M 细胞增殖周期阻滞于G1 期,延缓肿瘤细胞增殖速度.

　　2.1.5对人喉癌细胞株Hep-2 抗增殖作用的影响

　　人参单体皂苷Rh2 可明显抑制Hep-2 细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性.用30 mg/ L 人参单体皂苷Rh2 处理细胞24 h 后,G期细胞由60.09 %显著增加至68.86 %,S 期细胞由18.89 %明显减少至l2.30 % ,G2 / M 期细胞及凋亡细胞无明显变化,细胞阻滞于G1 期 .提示人参单体皂苷Rh2 对人喉癌细胞株He-2 具有明显的抑制增殖作用,使细胞阻滞于G1 期.

　　2.1.6对人类乳腺癌细胞MCF-7 增殖的抑制作用

　　人参皂苷Rh2 可显著抑制MCF-7 细胞的生长,并呈剂量依赖关系,使细胞停留在G1 期[.经Rh2处理细胞,其周期蛋白D 3 水平下降,而抑制Cdk 2活性的p 21WAF 1/ CIP 1 水平上升.Rh2 可显著降低磷酸化pRb 的水平和转录因子E2 F-1 的水平.

　　2.1.7对裸鼠体内人卵巢癌细胞肿瘤的生长抑制作用

　　在体外只需10～60μmol/ L 的Rh2 即可抑制多种人卵巢癌细胞的增殖,且IC50 剂量可诱导细胞凋亡.Rh2 经口服给药较腹腔给药效果佳,经口服给药除具有增加N K 细胞活性的功效外,亦可诱导细胞凋亡.

　　2.1.8 对Bel-7404 细胞及人肝癌SMMC-7721 细胞的作用

　　流式细胞术证实人参皂苷Rh2 对体外培养的Bel-7404 细胞具有诱导凋亡的作用,细胞凋亡率(AR) 随人参皂苷Rh2 质量浓度的增高和作用时间的延长而升高,当人参皂苷Rh2 质量浓度由12.5 mg/ L 增高至50.0 mg/ L 时, AR 则由16.2 %升高至27.5 % ,但人参皂苷Rh2 质量浓度由50.0 mg/ L 增高至100.0 mg/ L 时,AR 却未见相应升高.人参皂苷Rh2 以时间依赖性和浓度依赖性抑制人肝癌SMMC-7721 细胞的增殖,10 mg/ L 人参皂苷Rh2 作用6 d 后,抑制率达50 % ,而20 mg/ L人参皂苷Rh2 作用4 d 后抑制率近50 %.10 ,20 mg/ L人参皂苷Rh2 作用于SMMC-7721 细胞后,AFP 合成量明显下降,分泌量亦从6.60 ±0.30显著下降到2.35 ±0.06 ,γ-GT 及耐热型ALP 活性显著降低,而不耐热型ALP 活性及Alb 分泌量则显著升高.

　　2.1.9对白血病HL260 细胞凋亡的诱导作用

　　MTT 结果显示,用0～60μmol/ L 人参皂苷Rh2 分别处理HL-60 细胞24 ,48 ,72 h 后发现, HL-60 细胞的增殖明显受到抑制,且呈现浓度依赖性.人参皂苷Rh2 作用于H-60 细胞48 h 后, IC50 为25μmol/ L.

　　2.2 抑制肿瘤转移的作用

　　通过人参皂甙Rh2 对癌细胞转移影响的实验发现,人参皂甙Rh2 对小鼠B16-BL6 黑色素瘤细胞转移株自发性肺部转移具有显著的抑制作用,25 ,52 mg/ kg Rh2 作用后小鼠的肺转移抑制率与对照组相比较有显著性差异,8.3 ,16.6 mg/ kg Rh2 预先给药后,小鼠肺转移抑制率分别为44 % ,64 %.

　　2.3对免疫功能的影响

　　人参皂苷Rh2 注射液可提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及血清溶血素抗体的生成能力, 提高小鼠N K细胞杀伤活性和IL-2 活性.

　　2.4抗过敏反应

　　人参皂苷Rh2 可明显抑制IgE诱导RBL ,2H3 细胞释放β-氨基己糖苷酶( IC50 为0.1 mmol/ L) 和小鼠被动皮肤过敏反应,且作用强于色甘酸钠.

　　2.5抗耐药作用

　　顺铂为临床广谱抗肿瘤药物,可诱导多种肿瘤细胞凋亡 .通过人参单体皂苷Rh2增强顺铂对PC-3M 致凋亡效应的研究发现,顺铂与Rh2 联合应用可提高顺铂对前列腺癌细胞的诱导凋亡效应.

　　2.6抗增生作用

　　在培养小鼠成纤维细胞过程中发现, 人参皂苷Rh2 对DNA 合成具有抑制作用.