人参皂苷Rh2 两种差向异构体的HPLC含量测定

　　[摘要] 目的:建立2种人参皂苷Rh2 异构体的高效液相色谱测定方法。方法:采用Merck L ichro-spherRP218e C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm, 5μm) ,流动相为CH3 CN-CH3OH (65∶35) ,检测波长为203 nm,流速为1.0mL·min- 1。结果: Rh2 线性范围为0.06～1.20 g·L- 1 ,以峰面积( y)对浓度( x, g·L- 1 )求得线性方程, S构型线性方程为y =2 260.9x - 12.533, r =0.999 9; R构型线性方程为y =2 596.1x - 7.965 4, r =0.999 9。结论:本方法简便、准确、可靠,可用于Rh2 中的2种差向异构体化合物的鉴别和含量测定。

　　[关键词] 20 (S)-人参皂苷Rh2 ; 20 (R)-人参皂苷Rh2 ;高效液相色谱法;含量测定

　　1981年,日本的天然药物学专家北川勋等人,首次从红参(人参经蒸制、烘干后得到的制成品)中发现了一种人参皂苷次生苷———人参皂苷Rh2 ( ginsenoside-Rh2 ) ,大量研究发现Rh2 具有抑制多种癌细胞增生和转移的活性。然而,由于红参中人参皂苷Rh2 的含量极低,平均只有十万分之一,因此仅通过提取,从红参获得Rh2 达到工业化应用成本将非常高。近年来,国内外学者根据人参皂苷Rh2 为一种人参皂苷次生皂苷的特性,尝试生物转化法、化学转化法等多种形式获得人参皂苷Rh2 ,业已取得了突破性的进展。但是,人参皂苷Rh2 具有2个构型,见图1和2,在对S和R构型的鉴别和含量测定方面目前尚没有成熟的方法。

　　仪器与试药

　　Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent 1100 四元泵,变波长扫描紫外检测器,柱温箱,自动进样器,Agilent化学工作站,美国Agilent公司) 。人参皂苷Rh2 对照品(云南白药集团股份有限公司,批号:20030201, S、R 构型对照品以二极管阵列分析纯度均> 98% ) ;甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯均为分析纯。

　　方法与结果

　　1　液相色谱条件

　　色谱柱为Merck LichrospherRP-18e柱(250mm ×4.6 mm, 5μm) ;流动相为CH3 CN-CH3OH ( 65∶35) ;检测波长为203 nm,流速为1.0 mL·min- 1 ,柱温为30 ℃。

　　2 溶液的制备

　　2.1　对照品溶液　精密称取20 (S )-人参皂苷Rh2和20 (R )-人参皂苷Rh2 对照品各5 mg,分别置10mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得。

　　2.2　供试品溶液　取供试样品10 mg,置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得。

　　3两种人参皂苷Rh2 异构体HPLC定位

　　分别精密吸取上述2种对照品溶液和供试品溶液各5μL,注入色谱仪,测定。结果见图3。

　　专属性试验

　　用溶剂空白作参照,均取5μL注入HPLC进行测定,结果见图4。可见按此方法测定,空白溶剂对样品的测定不产生干扰,方法专属性好。

　　线性关系考察

　　精密称取20 ( S )-人参皂苷Rh2 对照品30.1mg,甲醇溶解后定容25 mL, 则其浓度为1.204g·L- 1。分别精密量取相应体积,稀释成浓度分别为0.060 2, 0.120 4, 0.240 8, 0.481 6, 0.602 0, 0.722 4,0.963 2, 1.084, 1.204 g·L - 1的系列对照品溶液,分别精密吸取5μL,注入色谱仪,记录色谱图。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得20 (S ) -人参皂苷Rh2 的线性方程为y =2 260.9x - 12.533, r =0.999 9,线性范围为0.060 2～1.204 g·L - 1。再精密称取20 (R )-人参皂苷Rh2 对照品30.2mg,甲醇溶解后定容25 mL, 则其浓度为1.208g·L - 1。分别精密量取相应体积,稀释成浓度分别为0.060 4, 0.120 8, 0.241 6, 0.362 4, 0.483 2、0.604 0,0.724 8, 0.966 4, 1.208 g·L - 1的系列对照品溶液,分别精密吸取5μL,注入色谱仪,记录色谱图。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得20(R)-人参皂苷Rh2 的线性方程为y = 2 596.1x -71965 4, r =0.999 9,线性范围0.060 4～1.208 g·L- 1。

　　精密度考察

　　分别制备0.5, 1.0, 1.5 g·L - 1的3个浓度供试品,每个浓度供试品制备3 份,分别取5μL 注入HPLC,测定S 和R 构型含量。S 构型含量平均值为44.52% ( n = 9) , RSD为1.323% ( n = 9) , R 构型含量平均值为49.06% ( n = 9) , RSD为1.798% ( n =9) , S 和R 构型总含量平均值为93.58% ( n = 9) ,RSD为1.526% ( n = 9) 。

　　准确度考察

　　精密称取样品9份,每份25 mg,分别在其中加入20 (S )-和20 (R )-人参皂苷Rh2 对照品,加甲醇溶解定容至25 mL。分别取该溶液和对照品溶液,注入液相色谱仪,按上述方法测定加样供试品溶液中20 (S )-和20 (R )-人参皂苷Rh2 含量,计算回收率。20 (S )-和20 (R ) -人参皂苷Rh2 的加样回收率平均值( n = 9)分别为101.52%和102.97% , RSD分别为1.3%和1.2% ,结果见表1。

　　含量测定

　　照供试品溶液制备方法制备10批样品的供试品溶液,分别进样、测定20 ( S )-和20 (R )-人参皂苷Rh2 的总含量,结果分别为94.13% , 94.31%,93116% , 93.65% , 95.02%, 93.20% , 94.46%,94103% , 93.39%和93.42% ( n = 2) 。

　　讨论

　　人参皂苷Rh2 为S 和R 两个构型,研究表明S和R 构型具有相同的抗肿瘤活性,但是由于仅仅存在20位羟基空间位置的差异, S 和R 构型在鉴别和分离上存在较大的困难。本实验在对前人工作成果借鉴的基础上,通过对流动相调整及色谱柱的筛选,见表2,结果应用L ichrospherRP218e柱可使Rh2 的S和R 构型得到满意的分离效果。

　　综合考虑保留时间、分离度、峰形等因素,选定用Merck L ichrospherRP-18e色谱柱( 250 mm ×4. 6mm, 5μm)作为检测用柱。