人参皂苷Rh2 葡萄糖基转移酶活性测定体系的建立

　　摘要:[目的]建立人参细胞中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG):人参皂苷Rh2 葡萄糖基转移酶(UGRh2 GT)活性测定体系。[方法]以人参皂苷Rh2 为底物,以UDPG为葡萄糖供体,选取合适的温度和pH值,用提取的人参细胞酶液催化Rh2 生成Rg3 ,采用高效液相色谱法(HPLC)测定Rg3 的生成量,色谱柱为C18柱(150 mm ×4.6 mm) ,流动相为乙腈和水,梯度洗脱。[结果]人参细胞中UGRh2 GT活性测定体系的最优pH值是9.3,最优温度是34.1 ℃。[结论]建立的酶活测定体系能够较好较方便地测定UGRh2 GT的比活。

　　关键词　人参细胞;葡萄糖基转移酶;高效液相色谱;二次饱和D2最优设计

　　糖基转移酶类是普遍存在于生物体中能够通过建立糖苷键将糖基连接到特定受体的一类酶,它们大多结构不同,功能专一。在植物体内,糖基转移酶将核苷二磷酸活性糖分子以糖苷键连接到小分子的底物上。在人参细胞中,糖基转移酶在人参皂苷代谢过程中起到重要的作用,是人参皂苷生物合成的最后一步修饰反应,也决定了生成的人参皂苷具有不同的生物活性。因此,研究人参细胞中的葡萄糖基转移酶具有重要的意义。在人参毛状根中,陈欣等发现并提取分离了以对羟基苯甲酸为反应底物的糖基转移酶 。岳才军等在研究三七细胞中葡萄糖基转移酶时,发现并纯化了UDPG:人参皂苷Rd葡萄糖基转移酶。为此,笔者研究了人参皂苷Rh2 葡萄糖基转移酶活性测定体系,以期为人参细胞中葡萄糖基转移酶的进一步研究奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　研究对象。培养18 d(18天)的人参悬浮细胞。

　　1.1.2　主要试剂。尿苷二磷酸葡萄糖UDPG (Sigma) ;人参皂苷Rh2 ( s) 、Rg3 ( s) ，购于吉林大学;甲醇、乙腈,均为色谱纯;其他药品均为国产分析纯。

　　1.1.3　主要仪器。CR21G型高速低温离心机; LC-2010AHT型高效液相色谱仪; DZF-6050B型真空干燥箱; D-37520 Os-terode型离心机;WFJ 2100型分光光度计; PHS-3C型pH计。

　　1.2　方法

　　1.2.1　酶液的提取。称取20 g培养18 d经过减压过滤的人参细胞,用液氮速冻并在研钵中研细,分3次加入研磨液(pH值8.5, 200 mmol/L Tris-HCl缓冲液含5 mmol/L EDTA、10mmol/L 巯基乙醇和1.0 mmol/L PMSF)研磨30 min,使人参细胞中的酶液充分游离出来,随后研磨匀浆在20000 r/min下离心15 min。取上清液,弃去沉淀。

　　1.2.2　UGRh2 GT活性的测定。参考岳才军等的方法进行测定。提取的人参悬浮细胞酶液,以人参皂苷Rh2 为底物,以UDPG为葡萄糖供体,在pH值8.5、30 ℃下水浴30 min,用高效液相色谱法检测反应结果。

　　1.2.3　UGRh2 GT测定体系的优化。在人参细胞中,糖基转移酶酶反应的顺利进行需要酶蛋白、合适的pH值和温度、底物和糖基供体(UDPG) 。在优化酶反应体系时,确定酶上清液0.05 ml、50.0 mmol/L Tris-HCl缓冲液、5.0 mmol/L UD-PG、0.5 mmol/L人参皂苷Rh2 ,总体积0.2 ml,反应30 min。通过二次饱和D-最优设计,优化酶反应体系中缓冲液的pH值和反应温度。反应结束后,向反应体系中加入0.2 ml正丁醇终止反应; 12 000 r/min下离心10 min,取正丁醇相, 45 ℃下减压挥干正丁醇; 用0.05 ml HPLC级甲醇溶解,用于HPLC分析Rg3 生成量。二次饱和D-最优设计的因素与水平设计见表1,实施方案见表2。

　　1.2.4　Rg3 生成量的测定。

　　1.2.4.1　色谱条件。采用日本岛津LC-2010AHT液相系统,SPD-10AVP紫外检测仪,科瑞科技C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm) 。检测波长203 nm,柱温30 ℃,流动相为乙腈和水的梯度溶液,流速为1.0 ml/min。具体梯度条件为:当洗脱时间为0.01 min时,乙腈浓度为40.0%;洗脱时间为34.00min,乙腈浓度为60.4%;洗脱时间为39.00 min,乙腈浓度为100.0%;洗脱时间为45.00 min,乙腈浓度为40.0%。

　　1.2.4.2　标准曲线的绘制。精密称取人参皂苷Rg3 ( s)10.0 mg于50 ml容量瓶中,以色谱甲醇配制成0.20 mg/ml的溶液,然后稀释成0.10、0.01 mg/ml的Rg3 ( s)溶液。按Rg3 色谱条件,分别吸取0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00μg Rg3 ( s)溶液注入液相色谱仪中,以进样量为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为: y = 314 216x -855.4, R2 =0.999 8,线性范围为0.05～2.00μg。

　　1.2.5　蛋白质含量的测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白,按考马斯亮蓝法测定酶液中的蛋白质含量。

　　2　结果与分析

　　2.1　人参细胞UGRh2 GT提取液催化Rh2 生成Rg3 的高效液相色谱分析结果　在人参细胞酶液糖基转移酶活性检测中,人参细胞酶液,以Rh2 为底物,由UDPG提供葡萄糖基,在合适的温度和pH值条件下,催化底物Rh2 生成了新物质Rg3 (图1)。这表明在人参细胞中存在由Rh2 转变成Rg3 的反应过程。由此推断出如图2所示的反应过程。

　　注:A为标准人参皂苷Rh2 和Rg3 的HPLC分析图谱;B为人参细胞UGRh2 GT提取液催化人参皂苷Rh2 生成Rg3 的分析图谱; C为人参细胞UGRh2 GT提取液在100 ℃ 下灭活5min后催化人参皂苷Rh2 未能生成Rg3 的分析图谱。

　　2.2　二次饱和D2最优设计试验结果　由表3数据计算得到回归方程为:

　　Y ^= - 318.902 + 30.722X1 + 14.583X2 - 0.093 X1 X2 -1.473X12 - 0.201X22

　　式中,Y^ 为糖基转移酶比活; X1、X2 分别为pH值和温度。测得值Y与回归预测值Y ^ 高度拟合,得到的回归方程的R2 =1.000,说明模型真实可靠,能够较准确地反映客观实际,所得的回归方程符合实际情况。规化求解回归方程,得出当X1 =9.340, X2 =34.130时, Y^ 有最大值73.50,即当pH值为9.300,温度为34.100 ℃时,糖基转移酶有最大酶活为73.500 pkat/mg。

　　对回归方程规化求解的结果进行验证,所得的测得值为72.800pkat/mg,验证结果与规化求解的结果接近。

　　2.3 　pH值对糖基转移酶酶活的影响　当X2 分别取20.000、35.000、50.000时,得到pH值对糖基转移酶酶活的影响的3个曲线方程分别为:

　　Y1^ = - 107.642 + 28.862X1 - 1.473X12

　　Y2^ = - 54.722 + 27.467X1 - 1.473X12

　　Y3 ^= - 92.252 + 26.072X1 - 1.473X12

　　pH值对糖基转移酶酶活的影响的曲线图见图3。由图3可知, pH值对酶活的影响不显著。pH值在9.000左右时,人参细胞中糖基转移酶的酶活相对较高

　　2.4　温度对人参细胞中糖基转移酶酶活的影响　利用降维分析法对回归方程进行分析,当X1 分别取6.000、8.500、11.000时,得到温度对糖基转移酶的酶活的影响的3个曲线方程分别为:

　　Y1^ = - 187.598 + 14.025X2 - 0.201X22

　　Y2^= - 164.189 + 13.793X2 - 0.201X22

　　Y3^= - 159.193 + 13.560X2 - 0.201X22

　　温度对糖基转移酶酶活的影响的曲线图见图4。由图4可知,温度对酶活的影响显著,在不同pH值条件下,有其不同的最佳温度,在碱性条件下,温度的影响很相近,且在30～40 ℃内,人参细胞中糖基转移酶的酶活较高。

　　3　结论与讨论

　　作为Rg3 的定量分析方法,HPLC法操作简便,结果准确,重现性好。因此在该试验中,使用HPLC法测定Rg3的生成量。二次饱和D-最优设计通常被应用在农业试验中 ,但将二次饱和D-最优设计应用到生化试验,测定最优pH值和最优温度时,发现其能够减少试验次数,预测出最优值,并能通过降维分析直观地观察到pH值和温度对酶活的影响。

　　与优化前酶活测定方法相比,建立的UGRh2 GT活性测定体系能敏锐地测定UGRh2 GT酶活,是研究UGRh2 GT的前提。UGRh2 GT酶活的发现,为研究人参细胞中人参皂苷代谢提供了帮助。UGRh2 GT可以作为调控细胞中人参皂苷代谢的靶点。同时,UGRh2 GT的研究也丰富了人参细胞中葡萄糖基转移酶的信息。