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伯基特淋巴瘤与EB病毒的关系及其p53和bcl-2蛋白的表达

2017-10-17

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导读:伯基特淋巴瘤与eb病毒的关系及其p53和bcl-2蛋白的表达

  伯基特淋巴瘤与eb病毒的关系及其p53和bcl-2蛋白的表达

  中华病理学杂志 1998年第4期第27卷 *论著*

  作者:李佩娟 崔全才 王志永 何乐健 刘淑荣 刘彤华

  单位:*论著*

  关键词:伯基特淋巴瘤;疱疹病毒4型;人;dna;病毒;蛋白质p53;蛋白质bcl-2

  【摘要】 目的 了解伯基特淋巴瘤和eb病毒的关系及p53和bcl-2蛋白的表达。方法 采用pcr、原位pcr及免疫组化lsab方法,检测了28例伯基特淋巴瘤石蜡包埋的组织块。结果 发现8例eb病毒dna阳性,阳性率为28.5%, 8例阳性病例做了原位杂交, 其中3例为阳性。27例做了p53和bcl-2免疫组化检测,阳性病例各为12例(44.4%)和13例(48.1%)。ⅰ~ⅱ期和ⅲ~ⅳ期p53和bcl-2阳性病例分别为3例(23.0%)、9例(64.2%)和3例(23.0%)、10例(71.4%),两者均表现ⅲ~ⅳ期阳性率高于ⅰ~ⅱ期。χ2检验: p<0.05,差异有显著性。eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的有4例, eb病毒和p53同时阳性的有5例, eb病毒和bcl-2同时阳性的有4例,p53和bcl-2同时阳性的(包括eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的病例在内)共有9例,即eb病毒阳性的病例有半数以上合并p53和bcl-2阳性, 而p53和bcl-2则有70%左右阳性病例同时有阳性表达。结论 肿瘤内eb病毒dna阳性率和非洲型伯基特淋巴瘤不同,而和世界各地报道的散发型相似;肿瘤内p53和bcl-2表达ⅲ~ⅳ期明显高于ⅰ~ⅱ期; eb病毒、p53和bcl-2之间可能存在某些相互的影响。

  the correlation between burkitt′s lymphoma and epstein-barr virus in28 cases and their expression of p53 and bcl-2 proteins li peijuan*, cui quancai, wang zhiyong, et al. * department of pathology, beijing children′s hospital, beijing 100045

  【abstract】 objective to investigate the correlation between burkitt′s lymphoma and epstein-barr (eb) virus and its expression of p53 and bcl-2 proteins.methods polymerase chain reaction (pcr), in situ pcr and immunohistochemical techniques were applied to specimens from 28 cases of burkitt′s lymphomas on paraffin-embedded sections.results eb virus was found in 8 (28.5%) cases by pcr, of which 3 were positive by in situ pcr. positive rates for the expression of p53 and bcl-2 were 44.4% and 48.1% respectively. whereas in stages ⅰ-ⅱ and ⅲ-ⅳ, they were 3(23.0%), 9(64.2%) and 3(23.0%), 10(71.4%) respectively. both the expression of p53 and bcl-2 were high in stages ⅲ-ⅳ, low in stagesⅰ-ⅱ (p<0.05). the positive cases of eb virus in combination with the expression of p53 and bcl-2 protein, p53 protein and bcl-2 protein were 4,5,4 respectively and 9 cases were positive for p53 and bcl-2 protein. in other words, the positive cases for eb virus in combination with the expression of p53 and bcl-2 were 50%, whereas 70% were positive for both p53 and bcl-2.conclusions the positive rates of eb virus in our series are different from some reports of african-burkitt′s and similar to many other reports of endemic burkitt′s lymphoma. the expression of p53 and bcl-2 proteins are significantly correlated with stage; high in stages ⅲ-ⅳ and low in stages ⅰ-ⅱ. eb virus, p53 and bcl-2 proteins may affect each other.

  【key words】 burkitt′s lymphoma  herpsvirus 4, human  dna, virual  protein p53  protein bcl-2

  淋巴瘤是小儿时期最常见的恶性实体瘤之一,伯基特淋巴瘤又是小儿非hodgkin淋巴瘤中较常见的一型,此瘤属于未分化型小无核裂细胞淋巴瘤。恶性度高,病变发展迅速,多数病人预后很差,国外曾有很多报道,国内报道不多。伯基特淋巴瘤与eb病毒的关系及其p53和bcl-2的表达报道不多[1,2],我们复查了北京儿童医院病理科从1956年至1991年小儿淋巴瘤的材料,将其中典型的伯基特淋巴瘤28例进行了临床病理资料的分析,用pcr方法将石蜡包埋的组织块进行了eb病毒dna检测,并检测了肿瘤的免疫表型和p53及bcl-2蛋白的表达。

  材料与方法

  1.复查了1956~1991年54例伯基特淋巴瘤,挑选临床病理资料完整的28例进行以下各项检测。

  2.eb病毒检测:dna模板的提取:石蜡包埋组织,一次性刀片5 μm厚切片, 取3~5张蜡膜, 放入1.5 ml离心管中,常规二甲苯脱蜡, 梯度乙醇入水, 离心后组织用400 μl pk缓冲液悬浮,70℃水浴10分钟, 自然次序冷却后加蛋白酶k, 55 ℃消化3小时,等体积酚抽提,上清液加入2倍体积乙醇, 0.2 mol/lnasc沉淀, 12000r/min离心, te重溶沉淀。(1) pcr扩增:30 μlpcr扩增体积中含pcr缓冲液,200 μmol/l dntp, 50 pmol/l扩增引物(tc60:ccagaggtaagtggactt, tc61: gaccggtgcctt cttagg, 北京医科大学生化系合成),0.2 μg模板dna, 0.25 utagdna聚合酶, 经94 ℃1分钟, 55 ℃1分钟, 72 ℃ 1.5分钟扩增30个循环。电泳鉴定及southern转印:0.8μl扩增产物, 经3%琼脂糖凝胶电泳后,20 μl阳性病例扩增产物经琼脂糖电泳,照像后, 经southern转印至硝酸纤维素膜上后, 用α-p-dctp标记ebv-ban w核酸探针杂交后, 经严格冲洗, 放射自显影后观察结果。(2)原位杂交:对pcr扩增ebv检测阳性的8例进行原位杂交, raji细胞为阳性对照,p-2细胞为阴性对照,石蜡包埋组织5 μm厚切片, 常规脱蜡脱水, pbs冲洗, 0.1 mol/l hcl10分钟后,蛋白酶k消化37 ℃10分钟, 梯度乙醇脱水, 42 ℃预杂交2小时后加杂交液40~80μl/片, 42 ℃过夜杂交, 严格冲洗后, 经脱水、自然干燥,涂核-4乳胶,放射自显影7~10天后, d-76显影、定影, he复染观察。原位杂交探针标记:1850 kbq α-s-dctp(杜邦公司), 随机引物标记方法标记ebv-banw核酸探针(promega公司标记盒)。

  3.用免疫组化方法检测肿瘤的白细胞共同抗原(lca), uchl-1和l26,确定其免疫表型,p53和bcl-2蛋白, l26, uchl-1, lca和bcl-2为dako公司产品,p53为santa cruz biotechnology公司产品, stmp试剂盒为zymed公司产品。p53和bcl-2在组织脱蜡复水后用0.01 mol/l枸橼酸钠水浴煮至90 ℃10分钟,自然冷却10分钟后进行lsab法免疫组化染色(步骤略)。检测结果28例有1例肿瘤蜡块只剩边缘结缔组织,故取消, 只剩27例。阳性反应的评估:肿瘤细胞阳性观察标准:0%~25%为±,25%~50%+,50%~75%++,>75%+++。

  4.统计学处理用卡方(χ2)检验法。

  结果

  1.临床资料: 男21例, 女7例, 男女之比为3∶1。发病年龄以2岁至13岁,2~5岁10例, 6~9岁9例, 10~13岁9例。病变部位: 腹部13例,包括回肠7例(其中3例表现肠套叠症状和体征), 肠系膜淋巴结5例,腹腔1例; 颈淋巴结5例; 腹股沟淋巴结1例(其中1例伴有颅神经ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅵ损害和下肢瘫痪);鼻咽部2例; 纵隔1例。病期:根据ann arbor分期标准:ⅰ期: 7例,表现为单纯的局部肿物。ⅱ期: 6例,表现为局部肿物和附属淋巴结肿大。ⅲ期和ⅳ期: 14例, 有2个或2个以上部位肿块,伴有或无全身症状。

  2.病理表现: 28例全部表现为典型伯基特淋巴瘤的病理形态,瘤细胞大部分为一致的小圆细胞, 核膜较厚, 核染色质粗糙,核仁清楚, 呈弥漫排列,肿瘤细胞之间可见星天状分布的巨噬细胞(图1),肿瘤细胞之间尚可见到点状或片状坏死。免疫组化染色:27例全部表现为b细胞免疫表型,阳性细胞除1例在50%以下外, 其余阳性表达在50%以上。

  3.eb病毒检测:28例肿瘤dna pcr扩增产物中有8 例在122bp有特异性扩增带,并经southernblot证实产物为ebv-ban w(图2,3), 阳性率为28.5%。8例阳性病例原位杂交结果, 3例阳性(图4)。阳性信号主要分布在肿瘤细胞胞浆及胞核内,信号强度不等,最多者50%。原位杂交阳性的3例, 2例发生于结外, 1例发生于结内。

  4.p53检测结果:27例中12例表达50%以上有意义的阳性(图5),阳性率为44.4%,按病期分ⅰ~ⅱ期病人, 13例中阳性有3例,阳性率为23.0%,ⅲ~ⅳ期14例病人有9例阳性, 阳性率为64.2%。

  5.bcl-2检测结果: 27例中13例表达50%以上有意义的阳性,阳性率为48.1%。按病期分:ⅰ~ⅱ期病人13例, 阳性3例,阳性率23.0%;ⅲ~ⅳ病人14例, 阳性病人10例, 阳性率71.4%。

  6.p53和bcl-2检测结果:ⅲ~ⅳ期阳性率明显高于ⅰ~ⅱ期病人,χ2检验结果p<0.05, 差异有显著性。

  eb病毒、p53和bcl-2同时阳性4例, eb病毒和p53同时阳性5例, eb病毒和bcl-2同时阳性4例,即eb病毒阳性的病例有半数以上同时合并p53和bcl-2或其中之一阳性, p53和bcl-2同时阳性的

  图1 瘤细胞由大小一致的小圆细胞构成,核膜较厚,核染色质粗糙,核仁清楚,弥漫排列,瘤细胞之间散在星天状分布的吞噬细胞 he×800 图5 p53染色显示胞核内棕黄色阳性物质 lsab法×800

  m1:pbr322/hinf i marker,raji:阳性对照细胞(下同),

  1~8为病例号,m2:pbr322/bstn i marker

  图2 8例伯基特淋巴瘤pcr扩增产物凝胶电泳结果

  图3 图2中凝胶经southern blot,与α-p-dctp标记ebv-ban w核酸探针杂交放射自显影结果

  图4 2-s-datp标记ebv-ban w探针,瘤细胞胞浆内及核内有eb病毒感染 原位杂交 ×1500

  病例, 包括eb病毒、p53和bcl-2同时阳性的病例在内共有9例, 即p53和bcl-2同时表达阳性的占其阳性病例的70.0%左右。原位杂交阳性的3例有2例同时有p53和bcl-2阳性表达,另1例原位杂交阳性病例合并p53阳性表达, bcl-2为阴性。

  讨论

  病源学研究发现伯基特淋巴瘤和eb病毒关系非常密切,80%~90%的病人发现eb病毒基因和血液循环内eb病毒抗体[3]。此后世界各地也相继报道了与非洲淋巴瘤相似的病例,但肿瘤发生部位及其与eb病毒的关系和前者稍有不同。前者称为非洲型伯基特淋巴瘤,后者称为散发型或非非洲型伯基特淋巴瘤。和非洲型相比,非非洲型最常见的发病部位为腹部,eb病毒dna的阳性率只有20%左右[3]。我们的材料和国外报道的非非洲型相似, eb病毒阳性率为28.5%, 病变也以侵犯腹部为主。

  eb病毒和许多肿瘤关系很密切。除病毒相关因素外,最近很多研究表明,染色体和癌基因的突变与许多肿瘤的发生和病变的进展、治疗效果及病人预后关系非常密切[4,5]。

  p53是肿瘤的抑癌基因。p53突变是人类恶性肿瘤最常见的基因改变。由于癌基因的突变,使p53从抑癌基因转化成肿瘤基因。许多报道表明p53的突变或过度表达对淋巴瘤的发生和病变的进展起重要作用[5,6]。p53的突变多见于高度恶性的淋巴瘤,少见于低度和中度恶性淋巴瘤[7]。从病期看, ⅲ~ⅳ期病人阳性率时显著高于ⅰ~ⅱ期。

  原癌基因bcl-2已证实为凋亡相关基因。这种基因首先发现与滤泡型非hodgkin淋巴瘤密切相关,因而命名为b细胞淋巴瘤-2。这种基因正常位于第18对染色体,由于染色体7(14;18)转位, 造成bcl-2蛋白水平增高[4,8]。有报道,bcl-2的表达和肿瘤细胞分化程度、病变的进展、病人对治疗的反应及预后关系密切[9]。本组病人48.1%bcl-2呈阳性反应,从病期分析, bcl-2和p53相似, 阳性病例多见于中晚期病人。

  eb病毒阳性的病例有半数(4例)同时合并p53和bcl-2阳性, 有70%左右的病例p53和bcl-2同时表达阳性。murray等[8]曾报道,器官移植后淋巴组织增生性疾病包括淋巴瘤。他们发现eb病毒可以引起bcl-2的表达。从本组材料看,eb病毒、p53和bcl-2之间可能存在一些相互的影响。

  参考文献

  1bogedain c, alliger p, schwarzmann f, et al. different activation of epstein-barr virus immediate-early and early genes in burkitt′s lymphoma cells and lymphoblastoid cell line. j virol, 1994, 68:1200-1203.

  2rowe m, rowe dt, gregory cd, et al. differences in b cell growth phenotype reflect novel patterns of epstein-barr virus latent gene expression in burkitt′s lymphoma cells. embo j, 1987, 6:2743-2751.

  3dehner lp. pediatric surgical pathology. 2th ed. bultimore: williams & wilkins, 1987. 825-837.

  4yunis j, mayer mg, arnesen ma, et al. bcl-2 and other genomic alternation in the prognosis of large cell lymphoma. n engl j med, 1989, 320:1047-1054.

  5farrugia mm, duan lj, reis md, et al. alterations of p53 tumor suppressor gene in diffuse large cell lymphomas with translocation of the c-myc and bcl-2 proto-oncogenes. blood, 1994, 83:191-198.

  6icikawa a, hotta t, takagi norio, et al. mutations of p53 gene and their relation to disease progression in b-cell lymphoma. blood, 1992, 79:2701-2707.

  7said jw, barrera r, sinlaku ip, et al. immunohistochemical analysis of p53 express in malignant lymphomas. am j pathol, 1992, 141:1343-1348.

  8murray pg, swinnen lj, constandinou cm, et al. bcl-2 but not its epstein-barr virus-encoded a homologue, bhrf1, is commonly expressed in posttransplantation lymphoproliferative disorders. blood, 1996, 87:706-711.

  9hermine o, haioun c, lepage e, et al. prognostic significance of bcl-2 protein expression in aggressive non-hodgkin′s lymphoma. blood, 1996, 87:265-272.

  (收稿:1997-01-13  修回:1997-10-22)

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