人参皂甙Rh2抗乳腺癌细胞细胞侵袭和转移的实验研究

　　摘要:目的观察人参皂甙Rh2对人乳腺癌MCF7 /Adr 细胞侵袭和迁移的作用及其机制。方法:用MTT 比色法，检测人参皂甙Rh2( Rh2) 对MCF7 /Adr 细胞的活力; Transwell 小室测定其侵袭力和迁移力; Western blot 法检测细胞基质金属蛋白酶2( MMP2) 、MMP9 和核转录因子KappaB( NF-KB) 蛋白水平的变化。结果:用人参皂甙Rh2处理后，MCF7 /Adr 细胞生长受到抑制，且作用呈时效-量效依赖关系; 同时细胞侵袭和迁移能力明显降低; MMP2、MMP9 和NF-kB 蛋白的表达均明显减弱。结论:人参皂甙Rh2能够减弱MCF7 /Adr 细胞侵袭和转移，其机制可能与降低MMP2、MMP9 和NF-kB 蛋白表达有关。

　　关键词: 乳腺癌; 人参皂甙Rh2; 侵袭; 转移

　　人参皂甙Rh2是从红参中提取的天然活性成分,分子量为622，分子式为C36H62O8H2O，化学名为20( S)-人参二醇-3-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。人参及其单体因毒副作用小，且有逆转肿瘤耐药的作用。近年来，国内外一些学者先后报道，人参皂苷( GensenosideRh2) 对多种肿瘤细胞( 如小鼠前列腺癌、肺癌耐药细胞、小鼠黑色素瘤B16 细胞、皮肤乳头状瘤、小鼠前胃癌系细胞等) 具有增殖抑制和诱导凋亡作用; 但有关人参皂甙Rh2对耐药乳腺癌细胞侵袭、转移相关基因的研究尚报道甚少。为探讨Rh2在对乳腺癌侵袭转移的作用，本实验以人乳腺癌MCF7 /Adr 细胞为研究对象，观察Rh2对MCF7 /Adr 细胞迁移和侵袭能力及对MMP-2、MMP-9 和NF-kB蛋白表达的影响，研究Rh2抗乳腺癌转移侵袭的分子机制。

　　材料与方法

　　1 材料

　　细胞株人耐药乳腺癌细胞MCF7 /Adr，购自中国科学院上海细胞研究所。主要药物和试剂人参皂甙Rh2，纯度﹥ 99%，上海融禾医药科技发展有限公司生产。RPMI1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，均Invitrogen 公司生产;Matrigel 和Transwell Chamber，BD 公司生产; 培养皿和多孔细胞培养板，Corning 公司生产; 阿霉素和鼠抗β- actin 单克隆抗体，MTT，均Sigma 公司生产; 兔抗MMP2、MM9 多抗、鼠抗NF-kB，Santa Cruz 公司生产; 二抗羊抗兔及羊抗鼠，Rockland 公司生产。仪器培养箱和超净工作台，Thermo Forma 公司产品; 垂直式电泳仪和湿转装置，Bio-Rad 公司产品;低温高速离心机，Beckman Coulter 公司产品; Vmax 酶标仪，Molecular Device 公司产品; 倒置显微镜，日本Nikon 公司产品。

　　2 实验方法

　　人参皂甙Rh2使用前，以二甲基亚砜( DMSO) 溶解，用RPMI1640 培养液稀释至所需浓度。

　　2.1 MTT 法观察人参皂甙Rh2对细胞活力的影响用文献报道方法。

　　2.2 细胞体外侵袭实验细胞接种于覆盖Matrigel 的Transwell Chamber 的上室，用含0.5%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养。下室，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基; 48 h后，弃培液，用棉签轻柔拭去膜上方的细胞，经HE 染色后，在倒置显微镜下计数。

　　2.3 细胞体外迁移实验

　　迁移实验与侵袭实验方法相同; 但Transwell 小室底部膜的内表面上，未铺Matrigel 。

　　2.4 检测MMP2、MMP9 和NF-kB 蛋白的表达用Western blot 方法。

　　3 统计学方法

　　用SPSS 10.0 软件完成统计学处理，实验数据以均数± 标准差表示，组间分析比较，用t 检验，P <0.05 表示差异有统计学意义。

　　结果

　　1 人参皂甙Rh2对MCF7 /AdrR 细胞活力的影响MTT 检测结果显示，3 个较低剂量( 10，20，40μmol·L-1 ) 的人参皂甙Rh2作用于MCF7 /Adr 细胞，48 h 细胞存活率≥90%，与对照组相比差异无统计学意义( P > 0.01) ; 但2 个较高剂量( 80，160 μmol·L-1 ) 人参皂甙Rh2对细胞存活有显著的影响( P <0.01) ，见表1。因此，在实验中，人参皂甙Rh2的浓度分别采用无细胞毒性的10 ～ 40 μmol·L-1。

　　2 人参皂甙Rh2对人乳腺癌细胞侵袭的影响采用不同浓度( 10，20，40 μmol·L-1 ) 人参皂甙Rh2作用于MCF7 /Adr 细胞48 h 后，与对照组相比，人参皂甙Rh2明显抑制了MCF7 /Adr 细胞侵袭( P <0.01) ，其抑制率分别为26%，49% 和74%。不同浓度人参皂甙Rh2组间比较，差异也有统计学意义( P <0.01) ，见图1。

　　3 人参皂甙Rh2对人乳腺癌细胞的迁移的影响采用不同浓度( 10，20，40 μmol·L-1 ) 人参皂甙Rh2作用于MCF7 /Adr 细胞48 h 后，细胞穿到小室下面的细胞数，与对照组相比均明显减少( P < 0.01) 。其中， 10， 20， 40 μmol·L-1 的人参皂甙Rh2对细胞迁移的抑制率分别为23%， 52%和78%。3 个浓度人参皂甙Rh2间比较亦均有统计学意义( P < 0.01) ，见图2。

　　4 人参皂甙Rh2对MCF7 /Adr 细胞MMP2 、MMP9和NF-kB 蛋白水平的影响用不同浓度的人参皂甙Rh2处理MCF7 /Adr 细胞48 h 后，提取细胞总蛋白，Western blot 检测结果，如图3 所示。由图3 可见，与对照组相比，3个浓度( 10，20， 40 μmol·L-1 ) 的人参皂甙Rh2，均能降低MCF7 /Adr 细胞MMP2 、NF-kB 的表达( P < 0.01) ，并呈剂量依赖关系。人参皂甙Rh2对MCF7 /Adr 细胞MMP9蛋白的表达，同样有抑制作用，其中40 μmol·L-1 的人参皂甙Rh2作用最明显。

　　讨论

　　最新的研究发现，原人参二醇型皂苷，如人参皂苷-Rh2、Rg3、C-K 及其苷元20( S)-原人参二醇，具有明显的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤血管形成，提高机体抗肿瘤的免疫力以及拮抗肿瘤细胞粘附等。此外，Rh2还能增加多药耐药细胞株对化疗的敏感性。前文发现，人参皂甙Rh2能显著增强MCF7 /Adr 细胞对ADM 的敏感性，提高ADM 在细胞内的聚积; 同时人参皂甙Rh2也能明显抑制ADM 对细胞P -gp 水平的上调，从而证实人参皂甙Rh2确实具有耐药逆转作用。

　　本实验证实，Rh2对MCF7 /Adr 细胞的侵袭和迁移有明显的抑制作用，经Rh2处理的细胞侵袭力和迁移力，明显降低。在本次实验中检测到Rh2，能够明显降低MCF7 /Adr 细胞MMP2 和MMP9 蛋白的表达。NF-kB 是一类转录因子，它能够调控诸多正常的细胞生理过程，如炎症和免疫反应，细胞生长和凋亡等。NF-kB 同时能诱导MMPs 的表达和活化，在细胞外基质的降解和细胞迁移过程中，也起到重要的促进作用。本实验观察到，Rh2可明显抑制NF-kB 蛋白的表达。本实验证实，人参皂苷Rh2对MCF7 /Adr 细胞的侵袭和迁移有明显的抑制作用，经Rh2处理的细胞侵袭力和迁移力明显降低，其分子机制之一可能是通过减少MMP2 和MMP9 和NF-kB 的表达，降低了其对ECM 和基底膜的降解，导致细胞的侵袭力和迁移力降低。