人参皂苷Rh2对人乳腺癌T47D细胞的生长抑制作用的影响

人参皂苷Rh2 对人乳腺癌T47D 细胞的生长抑制作用及对Caspase3 表达的影响

朱君荣1 ,孙建国2 ,谢海棠3 ,娄晟1 ,陶宜富1 ,肖大伟4 ,王广基2

1南京医科大学附属南京市第一医院药剂科, 4临床药理室,南京210006 ,江苏;

2中国药科大学药物代谢动力学重点实验室,南京210009 ,江苏;

3皖南医学院弋矶山医院,安徽省药物临床评价中心,芜湖241001 ,安徽

2006211218 收稿　20071212

国家863 计划基金项目(2003AA2Z347A;2005AA2Z3C70)

朱君荣,女,硕士在读,主管药师,研究方向:药理学。

孙建国,通讯作者,男,助理研究员,研究方向:药物代谢动力学。

摘要　目的:研究人参皂苷2Rh2 (GS2Rh2 ) 对雌激素依赖性人乳腺癌T47D 细胞增殖和凋亡的影响,并对可能引起凋亡的机制做一初步探索。方法:采用MTT比色法观察GS2Rh2 对体外培养的T47D 细胞生长的抑制作用;用光学显微镜观察T47D 细胞用药前后的形态学变化;应用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化以及Caspase23 表达的变化。

结果:MTT比色法测定结果显示,T47D 细胞经GS2Rh2 作用后生长受抑制,呈剂量依赖性和时间依赖性,半数抑制浓度( IC50 ) 为21. 6μgPmL ; 光学显微镜显示

T47D 细胞经GS2Rh2 作用后呈较明显的凋亡形态学改变;流式细胞仪检测证实, GS2Rh2 能在一定浓度范围内诱导T47D 细胞凋亡,将细胞周期阻滞于G1期,并使Caspase23 表达增加。结论: GS2Rh2 能抑制体外培养的T47D 细胞增殖并诱导其凋亡。

Caspase23 表达增加可能是GS2Rh2 诱导T47D 细胞凋亡的机制之一。

关键词　人参皂苷2Rh2 ;T47D 细胞;生长抑制;细胞凋亡;Caspase23凋亡;Caspase23

中图分类号: R965. 2 ;R730. 261

文献标识码: A

文章编号: 100922501 (2007) 0620630205

实验室及流行病学研究结果均表明,乳腺癌致病危险因子与雌激素的暴露有关,而全球工业化污染的加重导致人类体内雌激素的实际负荷量增加,使乳腺癌发病率呈逐渐上升趋势。传统化疗药物普遍存在着选择性差、毒副作用大、易产生耐药等问题,因此探寻新的治疗药物具有重要意义[1 ,2 ] 。人参作为我国传统的名贵中药材,具有广泛的生物学活性。近年研究结果提示其成分之一人参皂苷2Rh2(GS2Rh2 ) 具有显著的抗肿瘤活性,如诱导黑色素瘤细胞分化、逆转耐药的白血病细胞、通过调节蛋白激酶C 的活性及糖皮质激素样受体的作用抑制肿瘤

细胞的增殖等[3～7 ] ,但其对雌激素依赖性乳腺癌的作用国内外均未见报道。本研究就GS2Rh2 对人乳腺癌T47D 细胞的作用及其可能的机制进行初步探讨,以期为临床治疗雌激素依赖性乳腺癌提供实验依据。

1 　材料与方法

1. 1 　试剂及仪器　T47D 细胞购自南京凯基生物有限公司;GS2Rh2 (云南白药天然药物研究院提供) ,溶解于DMSO 制成20 mgPmL 的储备液,临用前用PBS稀释;四甲基氮唑(MTT) 和碘化丙锭(PI) 为Sigma 公司产品。倒置相差显微镜(Olimpus) ; 流式细胞仪(Facscalibur Becton Dickinson) 。

1. 2 　细胞培养与传代　将T47D 细胞置于37 ℃、饱和湿度的5 % CO2 培养箱中开放培养,培养用RP2MI1640 培养液(含10 %小牛血清,青霉素100 UPmL ,链霉素100 mgPL) 。细胞呈单层生长,达80 %左右融合时用0. 25 %的胰蛋白酶和0.02%的EDTA 混合(1 :1) 消化液消化传代,每2～3 d 传代1 次,取对数生长期细胞进行实验。

1. 3 　MTT 实验检测细胞增殖　取对数生长期细胞,消化后,用含10 %小牛血清的RPMI1640 培养液配制成单个细胞悬液,调节细胞浓度为1 ×105 个PmL 。接种于96 孔板中,每孔200μL ,同时每孔设空白对照组。培养24 h ,更换培养液后,空白对照组不加药,实验组各加入不同浓度的GS2Rh2 ,使其质量浓度分别为2. 5、5. 0、10. 0、20. 0、30. 0 、40. 0μgPmL。每种浓度设3 个复孔,分别在加药后

24 、48 、72 h , 每孔加入5 mgPmL MTT 溶液20μL ,37 ℃继续培养4 h 后弃上清液,加入150μL DM2SO ,摇床上振荡10 min 使蓝紫色结晶充分溶解,用酶标仪于570 nm 处测定每孔光吸收值( A 值) ,计算细胞生长抑制率,并求算出半数抑制浓度( IC50 ) 。

1. 4 　显微镜观察细胞形态学变化　细胞处理方法同MTT法,倒置显微镜下观察细胞形态学变化并拍照。

1. 5 　流式细胞术检测细胞凋亡及Caspase23 表达

T47D 细胞消化后,接种浓度为5 ×105 个PmL 细胞于50 mL 培养瓶中,培养细胞24 h 进入对数生长期。换新鲜培养基, 用IC50 的近似质量浓度20μgPmL

GS2 Rh2 处理细胞,同时设空白对照组。继续培养48 h ,1 000 rPmin 离心10 min ,PBS 洗两次。实验分成3 个平行组,分别用流式细胞术分析细胞周期及Caspase23 表达,检测细胞凋亡情况。其简要步骤如下:用冷75 %乙醇固定12 h , 检测前1 500 rPmin10 min ,弃乙醇,PBS 洗细胞两次。用PBS 调节细胞浓度为1 ×106 个PmL , PI 100 mgPL 染色后,滤纸过滤,上机分析细胞周期。Caspase 23 表达率检测的操作步骤依据操作说明(CaspGLOWTM Fluorescein ActiveCaspase23 Staining Kit) 由专业技术员进行。用BD 公司提供的Cellquest 软件每份样品获取2 ×104 个细胞,再用Modfit LT 2. 0 软件程序分析细胞参数。每组实验重复3 次。

1. 6 　统计学处理　用SPSS 10. 0 软件完成统计学处理,实验数据以均数±标准差( x ±s) 表示,组间分析比较采用t 检验, P < 0. 05 表示差异有统计学意义。

2 　结果

2. 1 　GS2Rh2 抑制T47D 细胞的增殖活性

GS2Rh2对T47D 细胞的增殖具有明显的抑制效应,MTT 检测结果显示其抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强,呈现剂量、时间依赖性作用,培养72 h的IC50为21. 6μgPmL (表1) 。

表1 　不同质量浓度GS2Rh2 在不同时间点对T47D 细胞的生长抑制率( x ±s , n = 3)

组别剂量(μgPmL) 24 h 48 h 72 h

空白对照组- 0 0 0

GS2Rh2 组　2. 5 12. 6 ±3. 7b 15. 4 ±2. 6b 17. 8 ±4. 2b

GS2Rh2 组　5. 0 16. 8 ±3. 2b 23. 7 ±4. 7b 30. 8 ±4. 2b

GS2Rh2 组　10. 0 34. 9 ±3. 5b 41. 0 ±5. 2b 45. 6 ±3. 2b

GS2Rh2 组　20. 0 49. 7 ±5. 4b 57. 4 ±4. 2b 64. 2 ±5. 2b

GS2Rh2 组　50. 0 60. 5 ±7. 1b 70. 1 ±6. 0b 72. 6 ±6. 9b

GS2Rh2 组　100. 0 64. 4 ±6. 2b 72. 8 ±5. 3b 80. 0 ±3. 9b

与空白对照组比较b P < 0. 05

2. 2　细胞形态学变化

T47D 细胞经2. 5、5. 0μgPmL GS2Rh2 处理后,与空白对照组比较,细胞形态变化不明显。20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h 后的T47D 细胞较空白对照组细胞数目明显减少,高倍显微镜下可见空白对照组的细胞呈近圆形或多角形,细胞透亮,折光性好,核圆而大,细胞核形态正常,染色质分布均匀。实验组细胞形态变圆,与周围

细胞脱离,细胞膜完整,胞浆浓缩,胞内空泡增多,细胞核缩小变形,核染色质密度增高呈颗粒状或块状,并凝聚在核膜下。高剂量组(100. 0μgPmL) 处理的细胞大量出现坏死,细胞轮廓消失,核崩解(图1) 。

2. 3 　GS2Rh2 对T47D 细胞凋亡水平和细胞周期及Caspase23 表达的影响

凋亡细胞DNA 断裂形成不同大小的寡聚核苷酸片段(凋亡相关的内源性核酸酶激活的结果) ,在流式细胞计( FCM) 的DNA 直方图上表现为G0 / G1 期前形成特性亚二倍体峰( sub2G1 ) 。根据该峰所占比例,可行凋亡的定量分析。分析FCM的DNA 直方图结果(图2) ,经GS2Rh2 处理过的T47D 细胞在G0 / G1 期前出现一明显的亚二倍体峰,说明GS2Rh2 可以诱导T47D 细胞凋亡。

实验组T47D 细胞经20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h 后凋亡指数为15. 0 % ±1. 1 % ,显著高于空白对照组(2. 6 % ±0. 8 % , P < 0. 01) ;实验组G0PG1 期细胞比例为65. 9 % ±5. 1 % ,显著高于空白对照组(52. 9 % ±4. 8 % , P < 0. 01) ;实验组S 期细胞比例为18. 4 % ±1. 6 % , 显著低于空白对照组(28. 9 % ±2. 5 % , P < 0. 01 ) ; G2PM 期细胞比例实验组为15. 7 % ±2. 0 % , 与空白对照组比较( 18. 3 % ±2. 0 %) ,差异无统计学意义( P > 0. 05) 。实验组Caspase23 表达的细胞比例为17. 7 % ±4. 0 % ,显著高于空白对照组(5. 6 % ±2. 7 % , P < 0. 01 ,图3) 。

图1 　T47D 细胞经20. 0μgPmL GS2Rh2 处理前后形态学变化

A:空白对照组( ×100) ;B :实验组(20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h , ×100) ;C:空白对照组( ×400) ;D:实验组(20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h , ×400)

图2 　流式细胞术检测细胞周期及凋亡

A:空白对照组;B :实验组(20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h)

图3 　流式细胞术检测Caspase23 表达

A:空白对照组;B :实验组(20. 0μgPmL GS2Rh2 处理48 h)

3 　讨论

人参(Panax ginseng) 为五加科多年生草本植物,近年来研究表明人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性。GS2Rh2 是日本学者在红参中首次分离得到的人参皂苷单体,属于人参二醇组皂苷,它可以诱导分化或凋亡抑制多种肿瘤细胞的增殖与生长[8 ,9 ] ,如卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤等。其对正常组织毒性甚低,并有抗缺血损伤和过敏的药理作用。随着环境污染的加重等多种因素的影响,雌激素依赖性乳腺癌的高发生率备受瞩目,而寻找高效低毒的抗雌激素依赖性乳腺癌药物亦是当今研究热点之一。近年来对T47D 细胞的蛋白表达谱研究表明,该细胞具有高侵润性,恶性程度较MCF27 细胞高,因此,以T47D 细胞作为对象研究GS2Rh2对雌激素依赖性乳腺癌的作用及其机制具有重要的现实意义。

本研究结果提示, GS2Rh2 可诱导T47D 细胞形态学发生改变,诱导细胞凋亡,影响细胞增殖能力,抑制其生长,且这一变化在实验范围内呈剂量、时间依赖性作用。而GS2Rh2 对T47D 细胞的抑制作用与雌激素受体的关连性研究及GS2Rh2 在体内的药动学行为研究正在进行中。

本实验流式细胞仪检测显示,GS2Rh2 以IC50 的剂量作用于T47D 细胞48 h 后,实验组的凋亡指数明显高于空白对照组,G0PG1 期细胞比例较空白对照组明显增多,而S 期细胞数目减少,提示GS2Rh2对T47D 细胞的周期调控作用主要发生于G1 期,阻止其向S 期发展,从而抑制其DNA 合成。诱导细胞凋亡的因素很多,不同的因素诱导细胞凋亡的信号传导途径不同,Caspase 是一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,目前已发现14 个成员(其中人体中有11 种) 。根据Caspase 在细胞凋亡中的作用可以分为两类:起始型(Caspase28 ,9 ,10) 与效应型(Caspase23 ,6 ,7 等) ,其中Caspase23 是最关键的蛋白酶[1O] ,能直接裂解多个重要的结构与功能蛋白。在正常情况下,细胞质中的Caspase23 以无活性、相对分子质量约为32 000 的前Caspase23 形式存在。当凋亡启动后,通过级联反应,Caspase23 被激活,形成具有活性的等二聚体,可以将细胞膜骨架蛋白spectrin 降解为120 000 的产物(SBDPs) 。本研究结果表明,实验组Caspase23 的激活明显多于空白对照组,因此推测Caspase23 的激活参与GS2Rh2诱导T47D细胞凋亡,以期以此为途径深入探讨GS2Rh2诱导T47D 凋亡的机制,为临床治疗雌激素依赖性乳腺癌提供实验依据。

参考文献

1 　EI2Bayoumy K,Sinha R. Mechanisms of mammary cancer che2mopreventlon by organoselenium compounds [ J ] . Mutat Res ,2004 ;551 :181 - 197.

2 　Kim SW, Kwon HY, Chi DW, et al . Reversal of p2glycoprotein mediated multidrug resistance by ginsenoside Rg(3) [J ] . Bio2 chem Pharmacol ,2003 ;65 :l75 - 182.

3 　Kim HE ,Oh JH ,Lee SK, et al . Ginsenoside RH22 induces ap2 optotic cell death in rat C6 glioma via a reactive oxygen2and Caspase2dependent but Bcl2X(L)2independent pathway[J ] . Life Sci ,1999 ;65 :33 - 40.

4 　Ham YM,Chun KH ,Choi JS ,et al . SEK12dependent JNK1 ac2 tivation prolongs cell survival during G2Rh2 2induced apoptosis [J ] . Biochem Biophys Res Commun ,2003 ;304 :358 - 364.

5 　Tatsuka M,Maeda M,Ota T. Anticarcinogenic effect and en2 hancement of metastatic potential of BALBPc 3T3 cells by gin2 senoside Rh2 [J ] . Jap J Cancer Res ,2001 ;92 :1184 - 1189.

6 　Fei XF ,Wang BX,Tashiro S ,et al . Apoptotic effects of ginsen2 oside Rh2 on human malignant melanoma A3752S2 cells[J ] . Ac2 ta Pharmacol Sin ,2002 ;23 :315 - 322.

7 　Cheng CC ,Yang SM,Huang CY,et al .Molecular mechanisms of

ginsenoside Rh2 2mediated G(1) growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells[J ] . Cancer Chemother Pharmacol ,2005 ;55 :531 - 540.

8 　Wargovich MJ . Colon cancer chemoprevention with ginseng an2 dother botanicals [J ] . J Korean Med Sci , 2001 ;16 :81 - 86.

9 　Kim YS ,Jin SH ,Lee YH ,et al . Differential expression of protein kinase C subtypes during ginsenoside Rh2 2lnduced apoptosis in SK2N2BE(2) and C6Bu21 cells[J ] . Arch Pharm Res ,2000 ;23 :

518 - 524.

10 Brown JM,Attardi LD. The role of apoptosis in cancer develop2 ment and treatment response [J ] . Nat Rev Cancer ,2005 ;5 :231