人参皂试Rh2体外对小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用

　　人参皂试Rh2体外对小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用

　　摘要 体外实验证明人参皂贰Rh2在10 ug·ml-1的浓度下能明显抑制B16细胞的生长，并呈浓度依赖性，其1C50为4.1 μg·ml-1.。Rh2在10μg·ml-1浓度下对Bl6细胞有较强的分化诱导作用，表现为黑色素生成能力明显增加;形态向上皮样细胞分化;细胞呈网状结构;黑色素颗粒增多，生长变缓慢。细胞动力学研究结果表明，Rh:可使B16细胞阻断在G1期。提示Rh2对B16细胞具有分化诱导作用。

　　关键词 人参皂苷Rh2 ;分化诱导; B16黑色素瘤

　　人参(Panax ginseng C. A. Meyer)为五加科多年生草本植物，有诸多的生物学活性已为研究者们所瞩目。现代医学已表明，人参有抗肿瘤、抗衰老，抗辐射等多种生物学活性。人参皂贰被公认是一类主要的有效成分，迄今已确定结构的至少在30种以上。本文用体外实验方法研究了人参皂贰Rh2对B16细胞的分化诱导作用。

　　材料和方法

　　细胞系及培养条件 小鼠黑色素瘤细胞B16为在C57BL/6J小鼠传代的B16体外培养株。细胞培养在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，传代用0.25胰酶消化，每周传代2次。

　　药品与试剂 人参皂贰Rh2由吉林人参研究所提供，使用时用乙醇溶解;L-3, 5-3H-酩氨酸(比度1. 70 X 1012 Bq·mmol- 1)为中国科学院上海原子能研究所产品，DPH(1, 6-diphenyl 1, 3, 5-hexatriene)为Sigm。公司产品。

　　细胞生长曲线测定 取对数生长期的B16细胞，配成1X104个·ml-1的细胞悬液，分装于培养瓶中，每组3瓶，接种细胞的d2给药，对照组加入体积溶剂，给药后置37℃，含5% Cq的培养箱中培养，于不同时间取出一定量细胞，按台盼蓝排斥法，在光镜下计数活细胞数。

　　细胞形态学观察 收集经药物处理后的细胞涂片，晾干后Wright-Giemsa染色10 min。在Olympus/BH2型显微镜下(油镜)观查并摄影。

　　黑色素含量测定 B16细胞以1X105个·ml‘接种于10 ml培养瓶中，于接种细胞的d2加药，对照组加等体积的溶剂，每组平行3瓶。取经药物作用后的细胞用PBS洗涤3次，胰酶消化、计数，1000*g离心10 min收集细胞，细胞团溶于1 mol · L-1 NaOH和10%的二甲基亚枫中，室温放置30 min，在400 nm波长处测定吸收度，换算为106个细胞吸收度。

　　酪氨酸酶活力测定 收集经药物处理72 h的细胞及对照组细胞，用0. 05% EDTA洗涤2次，用橡胶刷将细胞收集于试管中，1000 X g离心10 min。弃上清液，细胞团混悬于0.8 ml的PBS( 80 mmol " L -1 pH 6 . 8 )中，4℃超声破碎细胞3次，每次10s，制备细胞匀浆液，测蛋白浓度。

　　酪氨酸酶测定 反应的总体积为0. 4 ml，内含L-酪氨酸0. 4μmol, 3, 4一二轻基一L一苯丙氨酸0. 04 μmol, L-3, 5-3H酩氨酸9.2 X 105 Bq"mmo·L-1, PBS(25 pmol·L-1, pH 6.8)及细胞匀浆液0.2 mol 37℃水浴温育1h，用10%三氯醋酸终止反应，用活性碳吸附未反应的酪氨酸。3000 X g离心15 min，取一定量的上清液放于含10 % Triton-X-100的甲苯闪烁液中，测定 cpm值，结果换算为cpm·h-1·mg-1蛋白值。

　　细胞周期分析 收集经药物作用后的各组细胞，1000 X g离心5 min，弃上清液，将细胞团打散后用95%乙醇固定12 h以上。用0.5%胃蛋白酶消化一定时间后，加入2.5 mg· ml-1 DAP I溶液及0.03 mg"ml-1 101溶液，混匀后用流式细胞光度计做单参数分析，每个样品测定20 000个细胞。实验数据用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。

　　结果

　　Rh2对B16细胞生长的抑制作用

　　从图1可见，不同浓度Rh2处理不同时间对B16细胞的生长有抑制作用，并呈浓度依赖性。Rh2浓度在10μg·ml-1时可明显抑制B16细胞的生长，其IC50为4.1 μg·ml-1，结果提示Rh2可明显抑制R16细胞的生长。

　　Rh2对B16细胞形态的影响

　　B16细胞在体外呈单层生长，生长不规则，具有少数圆形细胞，用Rh2处理细胞后，低浓度(2. 5μg·ml-1)时，细胞呈极性生长，平行排列，当用高浓度(10μg·ml-1)处理后，短时间内细胞同用低浓度处理后的细胞生长状况相似，随着时间延长细胞呈网状结构，黑色素颗粒增多，细胞生长变缓慢，细胞核缩小，胞浆体积增加。

　　Rh2对B16细胞黑色素含量的影响

　　B16细胞与正常黑色素细胞相比，黑色素合成能力低。当B16细胞被分化诱导剂诱导后，黑色素生成能力增加。用10 μg·ml-1浓度的Rh2对B16细胞处理4d后，黑色素含量明显增高，为对照组细胞的2倍，提示B16细胞经Rh2处理后，细胞黑色素生成能力明显增强(表l}。

　　Rh2对16细胞的酪氨酸酶活力的影响

　　酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，控制黑色素的合成。从图6中可以看出，用10μg·ml-1

　　度的Rh2与16细胞作用4d,酪氨酸酶活力明显升高，与黑色素生成能力成正比，提示Rh2导B16细胞向正常黑色素细胞分化。

　　Rh2B16周期移行的影响

　　细胞动力学研究结果表明，用10~20 μg·ml-1Rh2理的B16细胞，处理24 h后，G2+M

　　期峰明显降低，细胞被阻断于G1期。药物作用后的细胞G1期明显增加，S期明显减少(表3，图2)，说明Rh2黑色素细胞B16具有分化诱导作用。

　　讨论

　　癌细胞的分化诱导和癌的分化治疗，近年来研究非常活跃，而从植物中寻找抗肿瘤药物，

　　在国内外已成为抗肿瘤药物的一个重要组成部分。人参具有诸多的生物学活性已为研究者们所瞩目。据报导人参茎叶总皂贰( GSL )对人单核样白血病细胞U-937有较强的分化诱导作用，形态及功能上均出现向单核细胞成熟分化的特征，并表现出分化后的细胞周期动力学的特征性变化。本文利用体外试验方法研究了人参皂贰Rh2小鼠黑色素瘤细胞B16的体外抗肿瘤作用，并探讨了Rh2对B16细胞的分化诱导作用。结果表明，Rh210μg·ml-1浓度下能明显地抑制体外培养的B16细胞的生长，其ICS。为4 .1 μg · ml - 1黑色素瘤细胞作为一种分化诱导实验模型，具有独特的优点。黑色素生成能力增加，克隆形成能力降低以及形态改变可以作为分化标记。据文献报道维甲酸、佛波醋，二甲基亚矾可以诱导人黑色素瘤细胞分化。我们以小鼠黑色素瘤B16细胞为模型，研究了人参皂贰Rh2对B16细胞的分化诱导作用。结果表明，Rh2在10 ug·ml-1浓度下对B16细胞有较强的分化诱导作用，表现为黑色素生成能力明显增加;形态向正常上皮样细胞分化;细胞呈网状结构;黑色素颗粒增多，生长变缓慢。酩氨酸是黑色素合成的限速酶，控制黑色素的合成，用10μg·ml-1度的Rh2用细胞4 d,酪氨酸酶活力明显升高，于黑色素生成能力成正比，说明Rh2诱导B16细胞向正常黑色素细胞分化。细胞动力学研究结果表明，Rh2使B6细胞阻断在G1期，药物作用后，G1期细胞明显增加，S期明显减少，这进一步说明Rh2黑色素瘤细胞B16具有分化诱导作用，其作用机理值得进一步研究。