人参皂甙Rh2 注射液对荷肝癌( H22) 小鼠免疫功能的影响

作 者：葛迎春,李晨燕,任慧君,马天舒,刘　平

摘 要：本研究以荷肝癌(H22) 小鼠为实验模型,观察人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素、NK细胞毒活性和IL - 2 免疫指标的影响。

结果表明:人参皂甙Rh2 注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、增加血清溶血素抗体生成能力、促进小鼠脾NK细胞杀伤活性和IL - 2 活性。人参皂甙Rh2注射液明显提高荷瘤小鼠免疫功能。

关键词：人参皂甙Rh2 ;免疫功能;H22肝癌瘤株

人参具有广泛的药理作用,以往研究表明:人参能提高机体的免疫力[1 ] 。本研究以H22荷瘤小鼠为实验模型,进一步观察人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠免疫功能的影响。

1 　材料和方法

1. 1 　动物

昆明种小白鼠60 只,体重20. 74 ±0. 77g ,雌雄各半,由大连市药品检定所动物实验基地提供;H22肝癌瘤株由中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供;淋巴细胞(YAC - 1) 购自武汉大学菌种保藏中心。

1. 2 　仪器和试剂

PRMI - 1640 培养基(Gibco ,USA) ;胎牛血清(FCS ,中国医学科学院血液研究所购进,批号:200004) ;曲拉通(Triton X100 ,Sigma) ;还原型辅酶I (CoI ,NADH ,Sigma) ;阳性对照药:环磷酰胺(CP ,上海第十二制药厂,批号:011015) ;人参皂甙Rh2 注射液、无色透明液体,由吉林省中医中药研究院提供,批号: 010615 ; 鸡红细胞; Giemsa 染色液。CO2 培养箱(SANYO ,MCO - 175M,Japan) ;超净工作台(CJ - 1 ,苏州长桥净化设备厂) :紫外光度计(TU - 1221 ,北京瑞利分析仪器厂) ;自动酶标度仪(CliniBio ,EC) ;倒置显微镜(OLYPUS ,Japan) ;生物学显微镜;96/ 24 孔培养板(Costar ,USA) ;微量血凝计数板,离心机。

1. 3 　实验分组

实验随机分成6 组:正常对照组;无菌操作取荷肝癌(H22) 小鼠腹水,用0. 9 %生理盐水稀释至含1 ×107/ ml ,每只右腋皮下接种0. 2ml (2 ×106/ 只) 随机分成H22荷瘤对照组;H22阳性对照组(环磷酰胺,CP) ;H22人参皂甙Rh2 注射液高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组10 只。

1. 4 　实验方法

1. 4. 1 　人参皂甙Rh2 注射液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

给药方法: 小鼠接种瘤细胞24h 后开始给药, 正常对照组(注射等体积的生理盐水) ; H22荷瘤对照组(注射等体积的生理盐水) ; H22阳性对照组(腹腔注射CP ,20mg/ kg ×3 ,间隔3d 1次) ;H22人参皂甙Rh2 注射液高剂量组(40mg/ kg) 、中剂量组(20mg/ kg) 、低剂量组(10mg/ kg) ,每日静脉注射1 次,连续给药5d ,免疫动物后继续给药5d ,体积均为0. 1ml/ 只。细胞悬液制备:取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中,朝一个方向充分摇动,以脱纤维,用生理盐水洗涤3 次,离心2000r/ min ,10min ,弃上清,用生理盐水配成20 %(V/ V) 的鸡红细胞悬液。

吞噬功能测定:末次给药后,次日清晨每只鼠腹腔注射20 %鸡红细胞悬液1ml ,轻柔腹部,30min 后,颈椎脱臼处死动物,立即开腹吸取腹腔液滴在玻片上约0. 2ml ,玻片置入37 ℃,孵育30min 后,再用生理盐水中漂洗,除去未贴片细胞,晾干,以1∶1 丙酮甲醇溶液固定,4 %(V/ V)Giemsa - 磷酸缓冲液染色3min ,蒸馏水漂洗晾干。

显微镜下结果判定:油镜下计数巨噬细胞,每张计数100 个,计算吞噬百分率和吞噬指数。

1. 4. 2 　人参皂甙Rh2 注射液对小鼠体液免疫的影响———血清溶血素测定血凝法SRBC:绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4 ℃冰箱保存备用,可保存2 周。免疫动物及血清分离:取羊血,用生理盐水洗涤3 次,每次离心2000r/ min ,10min ,将压积SRBC 用生理盐水配成2 %(V/ V) 的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0. 2ml 进行免疫,5d 后,摘除眼球取血于离心管中,放置约1h ,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/ min ,10min ,收集血清。

凝集反应:用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释浓度的血清分别置于微量试验板内,每孔100μl ,再加入100μl 0. 5 %(v/ v) 的SRBC 悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37 ℃温箱孵育3h ,观察血球凝集程度。

1. 4. 3 　人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠NK细胞和IL - 2 活性影响[2 ,3 ]

1. 4. 3. 1 　接种方法和实验分组:同前。

1. 4. 3. 2 　给药方法:小鼠接种瘤细胞24h 后开始给药,每日注射1 次,连续给药10d。体积均为0. 1ml/ 只,于停药次日清晨断头处死小鼠,无菌取脾,检测NK细胞和IL - 2 的活性。

1. 4. 3. 3 　脾细胞悬液制备: 无菌取脾,放置在无血清的PRMI - 1640 培养液中,将脾剪成1mm3 ,用注射器芯研磨至单个细胞,过200 目尼龙网,1000r/ min 离心,10min ,按文献制备成细胞悬液,备实验用。

1 . 4. 3. 4 　NK细胞毒活性- 胞浆乳酸脱氢酶(LDH) 释放法:各实验组脾细胞为效应细胞0. 1ml (2 ×106 细胞/ 管) ,加淋巴细胞(YAC - 1) 悬液0. 1ml (2. 0 ×105 细胞/ 管) ,加小牛血清0.1ml ,补加培养液至1ml ,每组设5 个平行。自然释放管加YAC - 1 细胞悬液0. 1ml ,小牛血清0.1ml ,补加培养液0. 8ml 。最大释放管每管加YAC - 1 细胞悬液0. 1ml ,小牛血清0. 1ml ,补加1 %Triton - 1000. 8ml 。上各试验组置37 ℃,5 %CO2 的培养箱中,饱和湿度培养18h ,1000r/ min ,离心5min ,取全部上清液。加LDH 反应液3ml ,用分光光度计以340nm ,32 ℃恒温测定吸光度值。

1. 4. 3. 5 　IL - 2 的制备和活性检测: 　IL - 2 的诱生:无菌制脾细胞悬液方法同前,用PRMI -1640 培养液洗涤2 次,配成1 ×108 个/ ml 细胞悬液,每孔100μl ,加入96 孔培养板中,使每孔细胞为5 ×106 个。离心收集上清液,置- 20 ℃冰箱保存备用。制备活化的脾细胞悬液:无菌制脾细胞悬液方法同前,制成5 ×106 个/ ml 细胞悬液,加入ConA ,使其浓度为5μl/ ml ,置37 ℃,5 %CO2 饱和湿度培养48h ,收集细胞,离心2 次,重悬于PR2MI - 1640 培养液中,作为IL - 2 活性检测细丙。

IL - 2 活性检测:取- 20 ℃保存的IL - 2 上清液和检测小鼠脾细胞,在96 孔培养板中,每孔加入IL - 2 上清液和反应细胞各100μl ,阴性对照组加100μlPRMI - 1640 培养液,各设4 个平行样。置37 ℃,5 %CO2 饱和湿度培养48h ,每孔加入MTT(5mg/ ml) 10μl ,继续培养4h ,弃上清,加入酸化异丙醇100μl ,充分振荡后静置20min ,全自动酶标仪MTT法比色分析法测定IL - 2 活性(OD 值) 。

2 　实验结果

人参皂甙Rh2 注射液对小鼠免疫功能的影响(见表1 - 4)

表1 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

分　组 剂量 动物数 吞噬百分率( %)

(mg/ kg) (.x ±SD)

对照组- 10 33. 2 ±3. 01 41. 7 ±3. 47

H22 10 25. 70 ±4. 59Δ 37. 7 ±5. 40

H22 + CP 20 10 22. 3 ±3. 80ΔΔ 31. 4 ±6. 60ΔΔ

H22 + Rh2 40 10 43. 1 ±4. 53 3 3 67. 0 ±4. 67 3 3 3

H22 + Rh2 20 10 40. 6 ±2. 59 3 3 62. 2 ±5. 65 3 3 3

H22 + Rh2 10 10 38. 7 ±3. 27 3 58. 4 ±2. 68 3 3 3

H22Rh2 各剂量组与H22组比较有明显差异, 3 :P < 0. 05 ; 3 3 :P < 0. 01 ; 3 3 3 :P < 0. 001 ;H22和H22CP 组与正常对照组比

较显著降低,Δ:P < 0. 05 ;ΔΔ:P < 0. 01。

表1 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液各剂量组能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。环磷酰胺明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

表2 　人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠体液免疫的影响—血清溶血素抗体测定血凝法

分组 剂量(mg/ kg) 动物数抗体积数(.x ±SD)

对照组- 10 28. 4 ±6. 82

H22 - 10 20. 4 ±3. 89Δ

H22 + CP 20 10 12. 2 ±3. 12ΔΔΔ

H22 + Rh2 40 10 36. 6 ±4. 45 3 3 3

H22 + Rh2 20 10 35. 7 ±8. 27 3 3

H22 + Rh2 10 10 30. 4 ±3. 81 3

H22Rh2 注射液高、中剂量组和低剂量组与H22荷瘤对照组比较显著升高, 3 : P < 0. 05 ; 3 3 :P < 0. 01 ; 3 3 3 :P < 0. 001 ;

H22CP 组、H22与正常对照组比较有显著降低作用ΔΔΔ:P < 0. 001 ;Δ:P < 0. 05。

表2 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液各剂量组抗体数明显高于对照组和CP 组,说明人参皂甙Rh2 注射液组有明显促进荷瘤小鼠体液免疫功能的作用,而环磷酰胺组则明显抑制

体液免疫功能的作用。

表3 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤H22小鼠NK细胞活性的影响

分　组 剂量 动物数 LDU( IU) 细胞毒指数( %)

(mg/ kg) (.x ±SD)

对照组- 10 11. 59 ±1. 11 46. 62 ±7. 13

H22 - 10 8. 27 ±1. 63 24. 70 ±10. 69ΔΔ

H22 + CP 20 10 8. 43 ±0. 83 25. 63 ±6. 69ΔΔ

H22 + Rh2 40 10 10. 95 ±0. 93 3 40. 12 ±10. 73 3 3

H22 + Rh2 20 10 10. 32 ±1. 73 3 38. 94 ±11. 06 3

H22 + Rh2 10 10 9. 84 ±1. 65 3 33. 85 ±11. 92

人参皂甙Rh2 注射液各剂量组与荷瘤H22组比较, 3 3 :P < 0. 01 ; 3 :P < 0. 05 ;H22和H22 + CP 与正常对照组比较细胞毒指数显著降低,ΔΔ:P < 0. 01。

表3 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性明显增强,人参皂甙Rh2 注射液高剂量组IL - 2 活性显著高于荷瘤组。

表4 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠脾细胞IL - 2 活性的影响

分　组 剂量(mg/ kg) 动物数 IL - 2 活性(OD 值)

(.x ±SD)

对照组- 10 　　　 　0. 134 ±0. 021

H22 - 10 　　　　 0. 075 ±0. 029Δ

H22 + CP 20 10 　　　　0. 060 ±0. 017Δ

H22 + Rh2 40 10 　　　　0. 123 ±0. 032 3

H22 + Rh2 20 10 　　　　0. 089 ±0. 019

H22 + Rh2 10 10 　　　　0. 070 ±0. 022

H22Rh2 注射液高剂量与荷瘤H22组比较, 3 :P < 0. 05。H22和H22 + CP 与正常对照组比较,Δ:P < 0. 05。

表4 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液高剂量组IL - 2 活性显著高于荷瘤组。

3 　讨论

人参皂甙Rh2 是从人参中提取的单体皂甙成分之一。本研究进一步探讨人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠免疫功能的影响,结果表明:人参皂甙Rh2 注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和促进荷瘤小鼠血清中羊红血球抗体生成。NK细胞是细胞免疫中非特异部分,很多研究发现H22荷瘤机体NK细胞活性明显降低[4 ] ,本实验也得到同样的结果。即荷肝癌(H22) 模型组小鼠的NK细胞活性处于严重低下状态,而人参皂甙Rh2 注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性有明显增强。IL - 2 主要是由活化的辅助性T 淋巴细胞产生的细胞因子,IL - 2 具有自身正向免疫调节作用,但在大多数荷瘤机体, IL - 2 系统处于明显的抑制或紊乱,荷瘤小鼠的IL - 2 活性低于正常组,而人参皂甙Rh2 注射液高剂量组显著提高IL - 2 活性。人参皂甙Rh2 注射液通过调节和增强机体免疫功能,发挥其抗肿瘤作用。

参考文献：[1 ] 王本祥. 人参研究[M] . 天津:天津科学技术出版社,1985. 223 - 227.

[2 ] 杨贵贞. 免疫生物工程纲要与技术[M]长春:吉林科学技术出版社,1991. 48.

[3 ] 周道洪,沈元珊,赵曼瑞. 测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2 活性的新方法- MTT比色分析法[J ] . 中国免疫学杂志,1986 ,2(1) :39.

[4 ] 彭贵勇,袁爱力,蔡景修. 荷瘤小鼠脾细胞淋转NK和LAK活性[J ] . 上海免疫学杂志,1994 ,14(4) :196