肝癌基因治疗的效果

   肝癌是一种临床常见、恶性程度高的肿瘤，其中90%的患者们慢性肝炎和肝硬化病史。全世界每年约有100万人死于该病。临床治疗方法有了不少新的突破，但由于大部分肝癌患者对化放疗均不敏感，能手术根治的病人仅占15%，因此肝癌的整体治疗水平仍不理想。近年来，基因工程技术特别是基因治疗技术 (I肿瘤研究中的广泛应用为肝癌的治疗提供了新的手段。基因治疗，将体外分离克隆的基因，通过载体导入生物体内的靶细胞中进行 IllIg修饰和表达，以矫正突变基因或调控功能基因表达，达到预防治疗疾病的目的。

   肝癌基因治疗通常是指利用基因转移技术将特皮的遗传物质导入肿瘤细胞或体细胞内，通过遗传物质的表达或调合作用，直接或间接地杀伤、抑制肿瘤细胞。随着分子生物学和免 吃学技术的不断创新以及人类基因组功能研究的不断拓展，肝癌基因治疗的方法和内容不断得到充实，某些技术已经或有望在临床研比中得到进一步应用。

肝癌基因治疗的基本方法

   肝癌基因治疗有多种分类方法。根据基因治疗途径分为活体(inviv)直接转移和回体(exvivo)转移两种方法。前者是指将目的基因直接导入体内，并在宿主细胞内表达；后者是指选择合适的靶细在体外进行培养和基因修饰，然后将基因修饰后的细胞导入体依据转移基因的受体细胞不同，可分为生殖细胞基因治疗与体基因治疗。无论是何种治疗方法，均需要采取高效的转移方法适的载体，将目的基因导人细胞。目前，基因转移导人细胞的、主要包括以下四种：

   1.物理方法如电穿孔、显微注射、基因枪、电脉冲介导；

   2.化学方法主要是磷酸钙共沉淀法，其他包括DEAE-葡糖法、聚阳离子-DM50转染技术和多聚季镀盐等化学试剂转移；

   3.融合法主要包括原生质体、原生体球、脂质体融合法受体介导转移法。目前基因治疗研究中应用较多的是后两种方脂质体融合法的原理是将外源基因与脂质体混合后，DNA被脂 双分子层包裹，形成一个脂质与核酸的复合体，通过疏水和静电相互作用，复合体与细胞相互融合后被细胞内吞而使外源基因转至细胞内。受体介导转移法则通过外源基因与配体蛋白形成DN 蛋白质复合物，与细胞上特定的受体结合并由其介导进入细胞表达。

   4.生物媒介法是目前应用最广泛的基因转移方法，主要括以下五种载体介导转移系统。

   (1)逆转录病毒载体：逆转录病毒是一种RNA病毒，其作原理是通过将外源目的基因插入病毒基因组的特定区域，并去除有反式功能的病毒基因，构建既能表达外源基因又不能自我复制重组逆转录病毒载体。病毒感染进入细胞后，首先在细胞中反转剥合成双股前病毒DNA，前病毒DNA传送到细胞核内，整合到得主细胞染色体上，最终利用宿主细胞的RNA聚合酶，转录外源目的基因并持续稳定表达。Moloney小鼠白血病病毒是目前研究最多的逆转录病毒载体。逆转录病毒可容纳9kb大小的外源基因，感染效率高，表达稳定，操作较方便；其缺点包括随机整合后可能引起插入突变，病毒效价低亦是其不足之处。需要强调的是，由于逆转录病毒仅感染复制、分裂期细胞，而处于非分裂期的细胞不受感染，此特点对于增殖生长旺盛的肝癌细胞特别是转移性肝癌细胞的治疗更具有靶向特异性。

   (2)腺病毒载体：腺病毒是基因治疗最常用的载体系统。目前对腺病毒的分子生物学特性研究最为详细的是人腺病毒2型(Ad2)和人腺病毒5型(AdS)，大多数腺病毒制1小就是以Ad2和AdS为基础构建的。其构建原理是首先删除病前且组编码转录蛋白的巴基因，并将目的基因插入El区，利定的装配细胞(如293细胞，其基因组内的El基因可编码病毒，的包装蛋白) ，对重组病毒进行包装、扩增；重组腺病毒感染细胞后，其DNA释放，经核孔进入细胞核内，由于缺乏，故不能在宿主细胞内自我复制，仅可瞬时表达外源基因产物。毒载体可携带长达4--7kb的目的基因，能感染静止期及分裂 HlPIH胞，病毒效价高，不整合人宿主细胞的染色体中；但表达期，需反复使用并诱发体内免疫排斥是其主要缺点。

   (3)腺病毒相关病毒载体：腺病毒相关病毒是一类单股DNA，可感染处于各种状态的细胞，其中2型(AAV-2)研究最为以人。腺病毒相关病毒用于基因治疗的作用原理是通过该病毒载体、内外源基因整合到宿主细胞基因组中，并处于一相当稳定的潜伏状，通常外源基因不表达，只有在腺病毒或单纯瘤彦病毒感染同胞时，才可激活其表达。腺病毒相关病毒可外源插入4.5kb大小的基因片段，感染谱广，可稳定表达；不足之处是外源基因容量限、滴度不高、制备较为困难，常发生辅助病毒污染。

   (4)单纯瘤彦病毒载体：单纯痕彦病毒是双链DNA有包膜病午，其I型用于构建载体系统。单纯瘪彦病毒可容纳30kb大小的外源基因，不与宿主细胞整合，由于对神经细胞有亲嗜性，故在神吨系统疾病基因治疗研究中应用较广泛;其缺点包括细胞毒性大，准制备，有病毒复制可能。

   (5)症苗病毒载体：疫苗病毒为线状双链DNA病毒，病毒感染细胞后，其包膜迅速与细胞膜融合，将病毒核心颗粒释放至胞内，并依靠其自身系统进行转录和复制。症苗病毒能感染静止期及分裂期细胞，包装容量大，可容纳25--30kb大小片段，易于制备且病毒滴度高；缺点为表达短暂并具有免疫原性。

   上述各种基因转移系统已在基因治疗研究中得到广泛应用，比较而言，非病毒转移系统无病毒污染，安全性高，但转移效率低，所携带外源基因片段在胞内不稳定；病毒载体具有转移效高，胞内表达稳定，外源基因突变率低，部分载体还可将外源基整合至细胞基因组中稳定表达等优点，但免疫原性、细胞毒性和在的致突变作用仍是其最大的不足。肝癌基因治疗可采用上述各载体系统，通常可直接将质粒DNA注射至肝癌组织内，也可利病毒载体系统将外源基因片段通过门静脉、肝动脉或胆道注射导肝脏内或肿瘤内部。

   肝癌基因治疗所采用的载体系统需具备高效、稳定的特点，外目的基因维持于靶细胞内特异性表达也是肝癌基因治疗研究的要方向之一。基因治疗所选择的许多外源目的基因，如自杀基因抑癌基因、反义核酸片段等，需要选择性地在肝癌细胞内高效达，才能准确杀伤肿瘤细胞，减少对正常细胞的毒副作用。目前许多肝癌基因治疗的载体系统选择肝癌特异性调控元件(启动子增强子)来驱动外源基因在肝癌细胞中的表达。如AFP启动子或启动子中的增强子序列较为常用，由于80%以上的肝癌细胞表边AFP，因此目的基因导人此类肝癌细胞后，上调AFP表达的转录调控元件同样可诱导外源基因表达，达到选择性杀伤肿瘤细胞的作用；而在正常细胞内缺乏AFP转录因子活性，因而不表达外源基因，不受基因导人的影响。进一步研究寻找仅在肝癌组织中高特异性表达的转录蛋白、信号调节蛋白以及与其结合的顺式作用元件是增强肝癌基因治疗特异性及靶向性的关键环节。