人参单体皂苷Rh2 诱导小鼠前列腺癌RM21 细胞凋亡

　　何静春, 孟　艳, 赵洪艳, 赵丽娟, 赵雪俭

　　(吉林大学基础医学院病理生理学教研室吉林大学前列腺疾病防治研究中心, 吉林长春130021)

　　[收稿日期] 　2006209216

　　[基金项目] 　中日政府间专项技术合作项目资助课题( 第59 项) ; 科技部国际科技合作重点项目资助课题

　　(2004DFB02000)

　　[作者简介] 　何静春(1977 - ) , 女, 吉林省吉林市人, 在读医学硕士, 主要从事肿瘤药理学研究。

　　出处：吉　林　大　学　学　报　( 医　学　版)

　　[摘　要] 　目的: 探讨人参单体皂苷Rh2 抗小鼠前列腺癌细胞RM21 的作用机制。方法: 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT) 还原法检测不同浓度Rh2 与RM21 细胞株存活率的关系; 吖啶橙染色观察Rh2 诱导细胞凋亡情况; 流式细胞仪分析细胞凋亡周期, 计算细胞平均凋亡指数。结果: RM21 细胞经Rh2 处理后, 细胞生长明显受抑制, 当Rh2 浓度为5 、15 、25 和30 mg ·L - 1时, 其生长抑制率分别为1210 %、3611 %、5112 %和6913 % , 呈明显的浓度依赖性; 吖啶橙荧光染色可见经药物处理的细胞呈现明显的凋亡形态; 细胞周期G1 期前出现凋亡峰, Rh2 浓度为15 和25 mg ·L - 1时, 细胞凋亡率分别为4119 % 和4819 %。结论: 5～30 mg ·L - 1 Rh2 可诱导RM21 细胞凋亡, 其具有明显的抗肿瘤作用。

　　[关键词] 　细胞凋亡; 人参单体皂苷Rh2 ; 前列腺肿瘤; 细胞周期

　　[中图分类号] 　R737125 　　[文献标识码] 　A

　　Apoptosis of RM21 prostatic cancer cells induced by ginsenoside Rh2

　　HE Jing2chun , MEN G Yan , ZHAO Hong2yan , ZHAO Li2juan , ZHAO Xue2jian

　　(Department of Pathophysiology , School of Basic Medical Sciences , Prevention and Treatment Research

　　Center for Prostate Diseases , J ilin University , Changchun 130021 , China)

　　Abstract : Objective 　To study the mechanism of ginsenoside Rh2 resisting RM21 prostatic cancer cells in vi t ro.Methods 　Af ter the RM21 cells were t reated with different doses of Rh2 , the cell viability was examined by MTTtest . The techniques of morphology and flow cytomet ry were used to analyze apoptotic cycle of RM21 cells and calculate apoptotic index. Re sults 　Af ter RM21 cells were t reated with Rh2 , the growth of cell line was inhibited.

　　When the doses of Rh2 were 5 , 15 , 25 , and 30 mg ·L - 1 , the apoptotic indexes were 1210 % , 3611 % , 5112 % ,and 6913 % , respectively. The apoptotic rates were 4119 % and 4819 % when the doses of Rh2 were 15 and 25 mg ·L - 1 . The RM21 cells t reated with Rh2 showed a typical apoptotic appearance and hypodiploid peak before G1 phase. Apoptotic index increased in time2 and dose2dependent manner. Conclusion 　Ginsenoside Rh2 can induce the apoptosis of RM21 prostatic cancer cells and has significant anti2tumor effect .

　　Key words : apoptosis ; ginsenoside Rh2 ; prostatic neoplasms ; cell cycle

　　前列腺癌多发生于老年男性, 美国自从进行前列腺特异抗原(prostate specific antigen , PSA)集团检诊以来, 临床前列腺癌的检出率明显上升[1 ] 。吉林省吉林大学前列腺疾病防治研究中心率先在国内开展前列腺癌集团检诊, 统计结果显示,1999 —2001 年前列腺癌平均例数较1986 —1989 年增长417 倍[2 ] 。前列腺癌发病率不断提高, 已逐渐引起肿瘤研究者的关注, 探寻有效的抗肿瘤药物,

　　以减少癌肿复发、转移, 进而提高患者生存质量已成为目前研究的重点之一。人参皂苷是人参中主要的有效成分, 迄今已被确定结构的至少有30 种以上, 人参皂苷Rh2 是从人参中提取的天然活性成分, 属于二醇组皂苷, 因Odashima 等[3 ] 报道从红参中提取的有效成分Rh2 在体外对黑色素瘤B16细胞具有分化诱导作用, 而细胞凋亡和增殖异常又与肿瘤的发生、发展密切相关, 故本研究旨在探讨

　　Rh2 干预体外培养小鼠前列腺癌细胞凋亡与增殖的作用机制。

　　1 　材料与方法

　　111 　主要试剂

　　人参单体皂苷Rh2 为吉林大学药学院天然药物化学教研室分离、提纯, 其浓度为20 g ·L - 1 ,用时以磷酸盐缓冲液( PBS) 稀释。四甲基偶氮唑蓝(MTT) 为美国Sigma 公司产品。

　　112 　细胞系及培养条件

　　小鼠前列腺癌RM21 细胞株购于北京大学医学部病理学教研室, 细胞培养在含10 %小牛血清的IMDM 培养液中, 置37 ℃、5 %CO2 的湿化培养箱中培养。培养细胞每周传代3 次, 待细胞长满80 %培养瓶时, 分组加药。

　　113 　实验方法

　　11311 　MTT 还原反应　取对数生长期细胞, 接种于96 孔培养板共5 组, 药物浓度为5 、15 、25 和30 mg ·L - 1 , 同时设对照组, 每孔200 μL培养液, 细胞密度为1 ×104 / 孔, 每组设4 孔。孵育20 h 后每孔加MTT (5 g ·L - 1 ) 20μL , 继续孵育4 h 后吸弃培养液, 每孔加入DMSO 溶液100μL , 震荡10 min , 用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度值( A ) , 计算细胞生长抑制率,抑制率≥30 %为细胞对该药敏感。抑制率= (对照组A 值- 给药组A 值) / 对照组A 值×100 %

　　11312 　细胞形态学观察　将10 mg 吖啶橙溶于100 mL 、p H 值为618 的PBS 中, 过滤后4 ℃避光保存。将Rh2 浓度为0 、15 、25 mg ·L - 1 3 组分别作用24 h 后的RM21 细胞制成细胞悬液, 浓度为1 ×107 ·mL - 1 , 取95μL 此悬液, 加入5μL 的吖啶橙储存液, 混匀, 荧光显微镜下观察, 照相。

　　11313 　流式细胞仪测量各期DNA 含量　传代培养的RM21 细胞经0125 %胰酶消化后, 计数, 台盼蓝拒染法测得活细胞数90 %以上。将此细胞接种于培养瓶中, 每瓶细胞1 ×106 , 24 h 后加药,Rh2 终浓度为15 、25 mg ·L - 1 , 对照组加等体积PBS , 各瓶终体积为4 mL , 24 h 后, 收集细胞、离心、吹打, 冷PBS 洗2 次。保留肿瘤细胞悬液015 mL , 用1 mL 注射器将以上细胞悬液迅速注入

　　4 ℃、70 %的冷乙醇中, 搅匀, 4 ℃冰箱固定24 h 。

　　用RNase 消化后, 加入115 mL PI (50 mg ·L - 1 )对DNA 进行染色。混匀后上流式细胞仪做单参数分析, 用累积曲线分割法计算各期细胞所占比例。G1 峰前面出现的亚二倍体峰即为凋亡峰。

　　114 　统计学处理

　　率采用%、平均值采用x ±s 表示。采用独立样本间两两比较的χ2 检验, 数据处理由SPSS910统计软件完成。

　　2 　结　果

　　211 　Rh2 对RM21 细胞生长的抑制作用　经0 、5 、15 、25 和30 mg ·L - 1 Rh2 处理后的RM21 细胞A 值依次为: 01651 ±0155 、01572 ±01029 、01416 ±0104 、01318 ±0133 和01199 ±01006 ; 5 、15 、25 和30 mg ·L - 1 Rh2 组生长抑制率分别为1210 %、3611 %、5112 %和6913 %, 与对照组( 0 mg ·L - 1 Rh2 ) 比较差异有显著性( P < 0105) , 且随Rh2 浓度增加, 抑制作用逐渐增强。

　　212 　细胞形态学变化

　　荧光显微镜下观察, 经15 和25 mg ·L - 1 Rh2处理后的RM21 细胞大多表现为凋亡细胞, 即细胞核浓缩, 细胞膜内陷, 细胞体皱缩, 并见凋亡小体, 细胞染色浅而淡, 胞内有不规则橘黄色颗粒。少数细胞体积增大, 胞膜破裂, 表现为坏死细胞。空白对照组细胞呈均匀绿色, 形态规则, 见图1(封二) 。

　　213 　Rh2 对RM21 细胞凋亡峰的影响

　　淡棕色峰代表正常的二倍体, 淡绿色峰代表亚二倍体, 即凋亡峰, 峰的高度代表凋亡率。空白对照组无明显凋亡峰。RM21 细胞经15 和25 mg ·L - 1 Rh2 作用24 h 后, 在G1 期前出现明显的凋亡峰。细胞凋亡率分别为4119 %和4819 %,

　　说明药物诱导肿瘤细胞凋亡呈剂量依赖性, 如图2(插页一) 所示, 细胞周期发生了明显的改变。S 期和G1 期所占的比例增多, 在Rh2 浓度为15 mg ·L - 1 时分别为4810 %和4512 % , 在Rh2 浓度为25 mg ·L - 1 时分别为3218 %和5811 % , 即Rh2 使细胞的生长阻滞在G1 / S 期。

　　3 　讨　论

　　前列腺癌是临床较常见的恶性肿瘤。目前对前列腺癌多采用内分泌治疗, 但患者在治疗一段时间后, 其癌细胞几乎均由雄激素依赖性变为雄激素非依赖性, 而导致肿瘤扩散和转移[5 ] , 结果使肿瘤细胞的生长无法控制而导致内分泌治疗失败[6 ] 。因此寻找一种治疗效果较好的药物就成为医药工作者的普遍共识, 本项研究旨在为临床提供一种有效的治疗前列腺癌药物, 并为该药物的应用提供实验依据。

　　凋亡异常与肿瘤发生、发展有着极密切的关系, 这也是近年来肿瘤防治领域的研究热点之一。细胞凋亡调控失败, 会引起细胞过渡增殖或凋亡减少, 从而导致肿瘤的发生。细胞增殖与凋亡失败决定肿瘤增长的速度, 其中比较重要的因素就是细胞周期的调控细胞被阻止在G1 / S 期[7 ] 。目前已发现人参皂苷Rh2 对体外人肝癌细胞SK2HEP21 等肿瘤细胞的生长具有抑制作用, 且Rh2 对PC23M 细胞具有明显的抗肿瘤效应[8 ] 。

　　本实验结果表明, 15 和25 mg ·L - 1 的Rh2 作用于RM21 细胞24 h , 可诱导细胞凋亡, 并呈剂量依赖性。吖啶橙染色后观察到细胞凋亡程度也随剂量增加而逐渐加重。Rh2 干预后的细胞周期分布表明, 经15 和25 mg ·L - 1 Rh2 作用后, 细胞分布周期发生改变, 细胞被阻滞在G1 / S 期, 因此使细胞不能顺利地由S 期进入到G2 期, 进而进入细胞分裂期, 这种抑制的结果就会使细胞DNA 复制﹑DNA 合成明显减少。本实验也表明了由于核小体间DNA 断裂而形成的凋亡, 表明Rh2 在一定浓度范围内可以通过诱导细胞凋亡而非细胞毒作用抑制肿瘤生长。尽管如此, 就其抑制作用的信号传导途径仍需进一步探讨, 相信随着人类对人参皂苷药理作用及其机制的深入了解, 人参皂苷将在临床防治肿瘤方面具有广泛的应用前景。

　　[参考文献]

　　[ 1 ] Oliver SE , Gunnell D , Donovan JL , et al1 Comparison of trends in prostate2cancer mortality in England and Wales and t he USA [J ] . Lancet , 2000 , 355 : 178821789.

　　[ 2 ] 张　灵, 计国义, 赵雪俭. 前列腺癌集团检诊对临床前列腺癌诊断的影响[ J ] . 中华泌尿外科杂志, 2004 , 25 ( 2) :1032106.

　　[ 3 ] Odashima S , Ohta T , Kohno H , et al . Cont rol of phenotypicex pression of cultured B16 Melanoma cell by plantglycosides [J ] . Cancer Res , 1985 , 45 : 2781.

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　　[ 5 ] Sediman AD , Scher HI , Pet rylak D , et al . Estamustine and vinblastine : use of prostate2specific antigen as a clinical t rial end point for hormone ref ractory prostatic cancer [ J ] .J Urol ,1992 , 147 : 9312934.

　　[ 6 ] Kirby RS , Christmas TJ , Brawer MK, Management of hormone2ref ractory prostate cancer [ A ] . In : Kirby RS ,Christmas TJ , Brawer MK. Prostate cancer [ M ] .

　　2nd ed. London : Mosby , 2001 : 1872198.

　　[ 7 ] Cheng CC , Yang SM , Molecular mechanisms of ginsenoside Rh22mediated G1 growt h arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells [ J ] . Cancer Chemot her Pharmacol , 2005 , 55 (6) : 5312540.

　　[ 8 ] 周桂华, 孟　艳. 人参单体皂甙Rh2 对体外培养的前列腺癌细胞株PC23M 抑制效应的研究[J ] . 白求恩医科大学学报,

　　2001 , 27 (6) : 5952597.