HPLC法测定红参总皂苷中人参皂苷-Rh2 的含量

　　[摘　要]　目的: 采用高效液相色谱法(HPLC)测定红参总皂苷中人参皂苷-Rh2 的含量。方法: 乙醇提取红参中总皂苷, 乙醚萃取, 硅胶柱层析分离。纯化制备人参皂苷-Rh2, 色谱柱为惠普ZobaxODX(4. 6mm×250mm, 5μm); 流动相为甲醇∶水∶磷酸(87∶13∶0.2)。结果: 红参总皂苷中人参皂苷-Rh2 的含量为0. 25%。结论: HPLC法简便, 准确度高。

　　[关键词]　人参皂甙/分析; 红参; 色谱法, 高压液相

　　1992年宋长春等从引种西洋参叶中分离得到人参皂苷-Rh2。1993年马兴元等从引种西洋参茎叶分离得到人参皂苷-Rh2。近年来, 未见有关人参皂苷-Rh2 提取方面的报道。红参中人参皂苷-Rh2 含量低, 一般方法难以检测出其含量。现以红参为原料分离提取总皂苷, 通过乙醚萃取, 硅胶柱反复层析,制得人参皂苷-Rh2, 经高效液相色谱归一化法测定其含量为98%以上。

　　1　材料与方法

　　1.1 仪器、材料与试剂

　　美国Waters 高效液相色谱仪, Waters 2478 双波长紫外检测器,Chromstation数据处理系统; 人参皂苷-Rh2 对照品含量98.3%(自制); 甲醇为色谱纯; 水为双蒸水; 硅胶G与硅胶H为青岛海洋化工厂出品; 硅胶G薄层板(自制); 溶剂系统CHCl3 ∶MeOH∶H2O(2∶2∶4下层); 所用试剂均为分析纯; 红参由吉林抚松县参茸联合公司提供。

　　1.2 提取分离

　　取干燥红参5.0kg, 加95%乙醇水浴加热回流3次, 过滤, 合并滤液, 回收乙醇得浸膏, 再用3倍量无水乙醇搅拌, 静置2h, 过滤,回收乙醇得总皂苷300g, 取总皂苷150g, 加水1500ml溶解, 乙醚萃取5次, 每次200ml, 合并萃取液, 平行操作1次, 回收溶液得人参皂苷-Rh2 组分共计20g, 经硅胶柱反复层析, 薄层跟踪, 分离得到白色化合物, 经重结晶(甲醇-水)得到无色针状结晶为50mg。

　　2. 结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱为惠普ZorbaxODS柱(4. 6mm×250mm, 5Lm); 流动相为甲醇∶水∶磷酸(87∶13∶0. 2); 流速0. 8ml·min- 1; 柱温40℃; 检测波长203nm。

　　2.2 线性关系

　　精密称取人参皂苷-Rh2 6mg, 置于10ml 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀,配制成每毫升含0. 6mg的溶液。精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8和10μl, 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件测定, 以峰面积积分值为纵坐标, 人参皂苷-Rh2量为横坐标, 绘制标准曲线, 回归方程: Y=740967. 8X- 95128. 7, r= 0. 9999。线性范围在0. 6～6. 0μg。

　　2. 3　精密度试验

　　吸取对照品溶液5μl, 重复进样5次, 测定峰面积积分值结果RSD为0. 86%。

　　2. 4　稳定性试验

　　取同一样品溶液10μl 依次平行测定5次, 结果其峰面积RSD为1. 53%。

　　2. 5　加样回收率试验

　　精密称取已知含量的同一批样品20mg, 分别加入对照品适量依法测定，计算回收率, 结果平均回收率为98. 86%, RSD为1. 33%(n=6)。

　　2. 6　样品测定

　　精密称取红参总皂苷500mg两份, 溶于20ml 水中, 用乙醚萃取5次, 每次10ml, 回收乙醚至干, 以甲醇定容于10ml 量瓶中。吸取10μl, 依上述色谱条件测定, 采取外标法计算,样品中人参皂苷-Rh2 平均含量为0. 25%, 见图1。

　　3. 讨论

　　采用HPLC检测红参总皂苷中人参皂苷-Rh2含量, 方法简便, 准确度高, 可达到质控目的。

　　1983年日本学者北勋川从红参中分离得到人参皂苷-Rh2, 并由小田岛肃夫进行了体外细胞抑瘤试验, 结果发现人参皂苷-Rh2 对小鼠的肺癌细胞、B16黑色瘤细胞、大鼠Monis 肝癌细胞的增殖具有明显的特异性抑瘤作用, 即诱导癌细胞分化逆转作用。人参皂苷-Rh2 有很强的生物活性, 但在红参中含量很低, 收率为十万分之一。国内学者用人参二醇与四乙酰溴化葡萄糖合成了与人参皂苷-Rh2结构极其相似的化合物。前苏联学者已半合成人参皂苷-Rh2。这一有意义的工作值得进一步探索。