人参皂甙-Rh2诱导人肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用

作 者：樊光华,姜　浩,欧文胜

摘 要：目的：研究人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)诱导肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用。

方法：应用流式细胞术检测GS-Rh2对肝癌Bel-7404细胞凋亡的诱导作用以及对细胞周期的影响。结果　流式细胞术证实GS-Rh2具有诱导凋亡作用,细胞凋亡率(AR)随GS-Rh2浓度增高和作用时间延长而升高,当GS-Rh2浓度由12.5μg/ml增至50.0μg/ml时,AR由16.2%升高至27.5%,但GS-Rh2浓度由50.0μg/ml进一步增至100.0μg/ml后,AR未见相应升高;GS-Rh2可将细胞周期阻滞于G1期。结论　GS-Rh2能诱导体外培养的Bel-7404细胞凋亡;GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡可能与细胞周期阻滞有关。

关键词：人参皂甙-Rh2;肝肿瘤;凋亡

近年来的研究发现,我国的名贵中药人参具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂甙(ginsenoside,GS)能诱导细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用[1,2]。人参皂甙单体-Rh2(ginsenoside-Rh2,GS-Rh2)是1种原人参三醇型皂甙,是红参的主要抗癌成分。本实验以人肝癌Bel-7404细胞株为受试对象,研究GS-Rh2的诱导凋亡作用,旨在进一步阐明中药人参抗肿瘤作用的机理,为将其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。

1　材料与方法

1.1　实验材料与主要仪器

人肝癌Bel-7404细胞株:由中国科学院细胞生物研究所引入,我院临床医学研究所传代培养。人参皂甙-Rh2购自中国科学院生物制品研究所,溶于PBS(pH 7.4)中配成50 mg/ml母液,超滤除菌,-20℃保存;RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品;小牛血清(FBS)为杭州四季青生物工程公司产品;酶联免疫检测仪由第四军医大学与国营华东电子管厂联合研制,型号为DG3022;流式细胞仪型号为Beckerman Coulter EPICS-XL。

1.2　实验方法

1.2.1　细胞培养　Bel-7404细胞用含10%小牛血清的培养液(含100 IU/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素),于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,细胞呈单层生长,达80%左右时传代。

1.2.2　药物处理　细胞传代后,接种于24孔培养板内,当细胞50%~60%融合贴壁良好时,换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测,分别探讨GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及时效关系。

1.2.3　GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析

根据前期实验结果,我们将GS-Rh2共设立5个浓度组,即a、b、c、d、e 5组,浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0μg/ml,培养24 h后分别收集各组细胞,然后通过流式细胞仪检测,探讨GS-Rh2诱导凋亡的量效关系并分析细胞周期。

1.2.4　GS-Rh2诱导凋亡的时效关系　根据我们既往采用MTT法检测GS-Rh2对Bel-7404细胞的生长抑制作用的结果,其半数抑制浓度(IC 50)为23.7μg/ml,故我们选取25.0μg/ml(IC 50的近似值)GS-Rh2分别作用0、12、24、48 h后,检测凋亡率。

1.2.5　凋亡细胞的检测　分别收集各组细胞,每组约1×106个,4℃PBS洗2次(pH 7.2),500 r/min,8min,离心去上清,然后加1.5 ml 70%乙醇重悬并固定细胞。经一系列处理后,上机检测,每组计数10 000个细胞,检测凋亡细胞,其中凋亡细胞所占比例即为凋亡率(AR);并分析处于不同周期的细胞比例。详细方法见参考文献[3,4]。

1.3　统计学处理

不同组间凋亡率比较采用χ2检验,P<0.05为有显著性差异。

2　结果

2.1　GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的量效关系与时效关系采用流式细胞仪检测凋亡细胞,各处理组凋亡率见表1、表2。

表1　不同浓度GS-Rh2作用下Bel-7404细胞的凋亡率(%)组别凋亡率P

a　　3.5(3 490/10 000)

b 10.2(1 015/10 000)　　<0.01*

c 21.5(2 150/10 000) <0.01*

d 27.5(2 753/10 000) <0.01*#

e 27.9(2 791/10 000) <0.01*#

*为与a组比较;#为d、e两组比较,P>0.05

由表1可见,细胞凋亡率(AR)随药物浓度增高而递增,但50.0μg/ml与100.0μg/ml组AR无显著性差异。

表2　GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的时效关系作用时间(h)凋亡率(%)P7404细胞的AR随作用时间延长而呈现递增的趋势。

0　　3.7(366/10 000)

12 8.1(813/10 000) <0.05*#

24 21.5(2 150/10 000) <0.05*#

48 39.6(3 957/10 000) <0.01*#

*为与0 h组比较;#为b、c、d两组比较,P<0.01

由表2可见,在25μg/ml GS-Rh2作用下,Bel-2.2　GS-Rh2作用后细胞周期变化药物处理24 h后收集细胞,用流式细胞仪检测各期细胞数(每组检测10 000个细胞),结果见表3。

表3　GS-Rh2对Bel-7404细胞周期的影响组别各期细胞数G1S G2/M

a 6 451 1 980 1 569

b 6 957 2 142　901

c 7 282 1 961　757

d 7 320 1 793　887

e 6 874 2 047 1 079

由表3可见,不同浓度的GS-Rh2可使G1期细胞明显增多。

3　讨论

中医药理论认为,人参具有健脾补气、宁神益智的功效,而现代药理学研究证实:人参具有抗肿瘤作用。本实验研究了人参中的1种活性成分—人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)对人肝癌Bel-7404细胞凋亡的影响,旨在进一步阐明人参抗肿瘤作用的机理,为肝癌的临床治疗提供更多的实验依据。细胞凋亡是1种由多基因调控的细胞主动死亡过程,在生理性刺激或较弱的外界刺激作用下,细胞内部的遗传程序被启动,核酸内切酶被激活,通过一系列复杂的生化过程后出现非随机性DNA降解。凋亡异常与肿瘤发生、发展有极密切的关系,是近年来肿瘤防治领域的研究热点之一。目前已从人参中提取出多种具有抗肿瘤作用的皂甙,并且对它们抗肿瘤作用的机制进行了大量研究。韩萍等[5]认为人参皂甙-Rg3有抗肿瘤生长的作用,与其它抗肿瘤药物,如5-氟尿嘧啶、长春新碱、环磷酰胺、氨甲喋呤等合用,有明显的协同作用。Kim等[6]研究表明GS-Rh2有诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡的作用。马文彬等[7]应用流式细胞仪研究GS-Rh2对S180肉瘤细胞周期移行的影响,发现GS-Rh2能引起细胞周期阻滞于S期。为进一步探讨GS-Rh2抑制细胞生长的机理,我们以Bel-7404细胞为研究对象,检测了GS-Rh2作用后细胞凋亡率(AR)以及细胞周期变化。

本实验结果表明,Bel-7404细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示:在一定范围内,GS-Rh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性和时间依赖性。50.0μg/ml组与100.0μg/ml组AR无显著性差异,说明GS-Rh2达一定浓度后,Bel-7404细胞的凋亡率不再随药物浓度的增高而增高。根据Anodrew等[8]的观点,细胞死亡是由正常的细胞周期改变引起的。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关,细胞阻滞于哪一期,凋亡就发生在哪一期。本实验结果还表明,GS-Rh2能阻滞G1期细胞向S期移行,使G1期细胞数量增多。故我们推测,当细胞周期被阻滞于G1期时,在药物作用下,部分肿瘤细胞发生凋亡,未发生凋亡的部分细胞进入S期。当联合使用GS-Rh2与其它主要作用于S期的抗肿瘤药物(如5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤等),则有可能通过“同步化”作用而产生协同效应。总之,我们的实验已证实GS-Rh2能诱导凋亡而发挥抗肿瘤作用,但关于其诱导凋亡的详细机制,还有待于进一步研究。

参考文献：[1]　陆平成,张　旭,周坤福,等.人参皂甙联合TNF对肿瘤的作用〔J〕.南京中医药大学学报,1995,11(4):27.

[2]　李　薇,易永林,李兆华.人参茎叶总皂甙对单核样细胞系U-937诱导分化作用〔J〕.白求恩医科大学学报,1994 ,20(4):384.

[3]　Aguilar Lemarroy A,Kirchhoff S,Whitaker N,et al.Dif-feren-tial sensitivity of human papillomavirus type 16(+)and type 18(+) cervical carcinoma cells to CD95-mediat-ed apoptosis〔J〕.Int J Cancer,2001,93(6):823.

[4]　韩　锐.抗癌药物研究与实验技术〔M〕.第1版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1994:4.

[5]　韩　萍,陈拯民.含人参皂甙-Rg3的药物可选择性抑制癌细胞〔J〕.国外医学·植物药分册,1994,9(2):89.

[6]　Kim SE,Lee YH,Park JH,et al.Ginsenoside-Rs4,a newtype of ginseng saponin concurrently induces apoptosis and selectively elevates protein levels of p53 and p21WAF1 in human hepatoma SK-HEP-1 cells〔J〕.Eur JCancer,1999,35(3):507.

[7]　马文彬,宋长春,马兴元,等.应用流式细胞光度计研究人参单体Rh1和Rh2对小鼠S180肉瘤细胞周期移行的影响〔J〕.白求恩医科大学学报,1991,17(6):551.

[8]　Anodrew L,Kung S,Anders Z,et al.Cytotoxic effects ofcell cycle phase specific angents:result of cell cycle pertur-bation〔J〕.Cancer Research,1999,50(4):7307.