人参皂带Rh2联合顺铂应用对人喉癌细胞Hep-2的作用

作 者：徐洪君,孟　艳,孙宇新

摘 要：目的　探讨人参皂甙Rh2与顺铂(Cisplatin, DDP)联合应用对喉癌细胞Hep-2的的作用。方法　体外培养的喉癌细胞Hep-2分别加入终浓度为0·5、1·0、2·0、5·0μg/ml的DDP、终浓度为10、20、30、40μg/ml的Rh2,以及终浓度为20μg/ml的Rh2分别联合终浓度为0·5、1·0、2·0、5·0μg/ml的DDP,设空白对照组,待药物作用48小时后,分别用光学显微镜、MTT法、流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)、荧光显微镜检测培养细胞的作用效果。结果　光镜下可见正常喉癌细胞细胞生长密集,细胞呈梭型或多角型,细胞彼此之间相接触。在低剂量Rh2组和DDP组,可见细胞数量略减少,细胞形态无明显改变。在高剂量Rh2组和DDP组,细胞数量明显减少,可见细胞碎片。而低剂量Rh2和低剂量DDP联合应用后,可获得与高剂量Rh2组和DDP组相同的效果。MTT结果显示Rh2、DDP单独应用和联合应用都呈剂量依赖性增加抑制喉癌细胞的生长。低剂量Rh2低剂量DDP联合应用,可明显抑制喉癌细胞生长。FCM显示Rh2和DDP单独应用,可诱导细胞凋亡,而联合应用可获得较单独应用更为明显的诱导细胞凋亡效应。吖啶橙染色显示各用药组均可见细胞胞膜出芽、染色质凝集、核片段化及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。结论　人参皂甙Rh2及DDP均可诱导喉癌细胞凋亡,二者联合应用后,呈现出协同作用,可发挥更为明显的抗癌作用。

关键词：凋亡;人参皂甙;顺铂;喉肿瘤

喉癌是常见恶性肿瘤之一,目前喉癌的治疗除了强调原发病的清除,更加注重喉功能的保留和重建。临床研究证明,术前诱导化疗可以明显降低病人远处转移的危险性,从而提高喉等器官保留的机率[1]。顺铂(Cisplatin, DDP)是临床常用的化疗药物之一,具有抗癌谱广、疗效确切等特点。但以DDP为主的化疗方案在提高癌症治疗效果的同时,因其副作用而限制在临床应用。人参单体皂甙Rh2是人参中抗肿瘤活性的主要成分,可诱导肿瘤细胞凋亡[2]。因此,人参皂甙Rh2与DDP联合应用,可能会对肿瘤的治疗起到协同作用,从而减少DDP的用量,以达到减少化疗药的毒副作用的目的。本文就人参皂带Rh2联合顺铂(DDP)对喉癌细胞Hep-2的作用作一初步探索。

1　材料与方法

1·1　实验材料　Hep-2细胞购于中科院上海科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,人参皂带Rh2由吉林大学药学院提供,原溶液浓度为20μg/ml。顺铂浓度为5μg/ml。

1·2　实验方法

1·2·1　喉癌细胞于含10%小牛血清的IMDM培养基中培养,在37℃、5% COS2孵箱中培养。细胞生长汇合达80%时,换用无血清IMDM培养液培养24h,分组加药,用以检测细胞生长活性及凋亡指标。

1·2·2　细胞毒性试验　采用MTT法:取对数生长期细胞,接种细胞于96孔培养板,细胞密度为1×106个/ml。设3个实验组:Rh2组分别加入终浓度为10、20、30、40μg/ml的Rh2,DDP组分别加入终浓度为0·5、1·0、2·0、5·0μg/ml的DDP,Rh2+DDP组分别加入终浓度为20μg/ml Rh2+0·5μg/ml DDP、20μg/ml Rh2+1·0μg/ml DDP、20μg/ml Rh2+2·0μg/mlDDP、20μg/ml Rh2+5·0μg/ml DDP、每组均设空白对照组。加药后,置于培养箱避光培养48小时。在结束孵育前4小时,每孔加MTT(5 mg/ml)20μl,继续孵育4h后吸弃培养液,每孔加入DMSO溶液100μl,震荡10 min,用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度(A值),计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=[1-实验组A值/对照组A值]×100%

1·2·3　细胞形态学观察　细胞处理方法同MTT法,用倒置显微镜照相,记录细胞形态学变化。吖啶橙染色时,取培养瓶装细胞,处理方法同上,于细胞孵育结束后,用0·25%胰酶消化贴壁细胞,置入试管内,以冷PBS(pH7·2,0·1 mol/L)清洗2遍后,试管内加入200μl PBS溶液,取95μl细胞液,加入5μl0·01%的啊啶橙染液,轻轻打匀后,取细胞悬液一滴置于洁净的玻片上,立即加盖盖玻片后,于荧光显微镜镜下观察。

1·2·4　流式细胞仪(FCM)检测　取对数生长期细胞,分别加入DDP(终浓度2·0μg/ml)、Rh2(终浓度20μg/ml)、DDP(终浓度2·0μg/ml)+Rh2(终浓度20μg/ml),设对照组。收集经药物作用后的1×106个细胞,冷PBS(pH7·2,0·1 mol/L)清洗2遍,70%的冷乙醇4℃固定后送检。

1·3　结果处理及统计　实验数据统计处理采用方差分析, t检验,数据用-x±s表示。

2　结果

2·1　光镜结果　正常对照组:细胞生长密集,细胞呈梭型或多角型,细胞彼此之间相接触,并可见少量漂浮的小圆形细胞。在Rh2组,加入低剂量Rh2(10μg/ml和20μg/ml)后,可见细胞数量略减少,细胞形态无明显改变,而加入高剂量Rh2(30μg/ml和40μg/ml)后,细胞数量明显减少,并可见较多的细胞碎片。在DDP组,加入终浓度0·5μg/ml DDP后,可见细胞数量略减少,细胞形态无明显变化;当加入终浓度2·0和5·0μg/ml DDP后,可见细胞数量明显减少,并可见较多的细胞碎片。在Rh2+DDP组,当加入20μg/ml Rh2和0·5μg/ml DDP后,就可见细胞数明显减少,以及较多坏死的细胞碎片,且其作用呈现出明显的剂量依赖性增加。

2·2　MTT结果　MTT结果显示低剂量的Rh2(≤20μg/ml)对喉癌细胞的生长抑制作用不明显,高剂量2(≥30μg/ml)具有明显的抑制作用(表1);DDP各个剂量分组都对喉癌细胞的生长具有抑制作用,并呈剂量依赖性增加(表2);Rh2与DDP合用后,DDP对喉癌细胞的抑制作用增强,明显高于单独应用同等剂量的DDP,并且呈剂量依赖性增强(表3)。

　　表1　DDP对Hep-2的抑制作用组别DDP终浓度(μg/ml)OD值(-x±s)抑制率(%)

　　正常对照组0　0.955±0.125 0

　　组1 0.5 0.705±0.043*26.2

　　组2 1.0 0.635±0.030*33.5

　　组3 2.0 0.519±0.065*45.6

　　组4 5.0 0.360±0.053*62.3

　　*P<0·05 vs正常对照组

　　表2　Rh2对Hep-2的抑制作用组别Rh2终浓度(μg/ml)OD值(-x±s)抑制率(%)

　　正常对照组0　0.955±0.125 0

　　组1 10.0 0.916±0.067 4.1

　　组2 20.0 0.841±0.056*12.0

　　组3 30.0 0.375±0.031*60.7

　　组4 40.0 0.178±0.018*81.3

　　*P<0·05 vs正常对照组

　　表3　Rh2联合DDP对Hep-2的抑制作用组别Rh2+DDP终浓度(μg/ml)OD值(-x±s)抑制率(%)

　　正常对照组0 0.955±0.125 0

　　组1 20.0+0.5 0.506±0.036*47.1

　　组2 20.0+1.0 0.453±0.057*52.6

　　组3 20.0+2.0 0.408±0.035*57.3

　　组4 20.0+5.0 0.215±0.036*77.5

　　*P<0·05 vs正常对照组

2·3　流式细胞仪检测结果　流式细胞仪测量结果表明,对照组有少量细胞凋亡;加入终浓度20μg/ml的Rh2时,可见一定数量的细胞凋亡,并且高于对照组,但差别不显著,细胞生长被阻滞在G0/G1期;加入终浓度0·5μg/ml DDP时,其凋亡率为8·61%,高于正常对照组,但差别亦不显著,细胞生长被阻滞在S期;当加入终浓度20μg/ml Rh2和0·5μg/ml DDP后,喉癌细胞的凋亡率高达33·46%,明显高于其它各组(表4)。

2·4　吖啶橙染色结果　荧光显微镜下见正常细胞呈均匀一致的翠绿色(图1),在高剂量Rh2组、DDP各剂量组及Rh2与DDP联合用药组,均可见有细胞胞膜出芽、染色质凝集、核片段化及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征(图2)。

　　表4　Rh2和DDP单独用药及联合用药对Hep-2的细胞周期的影响及凋亡率组别药物终浓度(μg/ml) G0/G1 S G2-M凋亡率(%)

　　正常对照组0 69.15 30.53 0.32 3.74

　　Rh220组20 90.83 8.32 0.84 8.18

　　DDP 0.5组0.5 55.37 44.13 0.50 8.61

　　联合用药组Rh220+DDP0.5 60.93 39.03 0.04 33.46

3　讨论

近年来,凋亡成为生命科学研究的热点之一。研究表明,肿瘤的发生和发展不仅是细胞增殖的结果,也是细胞凋亡受阻的结果。因此,肿瘤的治疗在某种程度上而言,就是诱导肿瘤细胞凋亡的过程[3]。本文通过实验证实人参皂带Rh2与顺铂联合应用后,可显著提高DDP对喉癌细胞Hep-2的抑制作用,并诱导喉癌细胞凋亡。实验表明,单独应用低剂量Rh2(≤20μg/ml)或低剂量的DDP(0·5μg/ml)对喉癌细胞的生长抑制作用不明显,但当低剂量Rh2与低剂量DDP联合应用后,可达到数倍剂量DDP的应用效果,表现出明显的协同作用。而且,Rh2单独应用可将喉癌细胞阻滞在G0/G1期,在此期,细胞合成rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体,是细胞复制的主要阶段,因此,G0/G1期是药物等因素作用的敏感点,细胞凋亡往往发生于G1期阻滞的细胞[4]。所以,通过应用人参皂甙Rh2将喉癌细胞阻滞在易凋亡时期,可明显提高细胞毒性药物的作用。顺铂为肿瘤细胞毒性药物,主要是通过抑制DNA合成实现其细胞毒作,并最终导致细胞凋亡[5]。并且,人参皂甙通过增加肝脏代谢各种化学物质的酶活性、促进肝微粒体中作为药酶的主要组成部分的P-450,从而增加了肝脏的解毒功能,提高机体对多种化学物质的耐受,因此,在化疗时同时应用人参皂甙可有效地减少化疗药物的副作用[6]。本研究证实了Rh2与DDP联合应用后,表现出协同作用,明显地提高了DDP的抗癌效果。提示在喉癌的化疗治疗过程中,应用人参皂甙Rh2可通过提高机体的耐受能力和提高化疗药物的药效的双重机制而最大限度地减少DDP的副作用,以达到提高化疗效果,减少病人痛苦、改善病人预后的最终目的。

参考文献：[1]Lefebvre JL, Chevalier D, Luboinski B, et al. Larynx preservation in pyriform sinus cancer:preliminary results of a European Organization for research and treatment of Cancer phaseⅢtrail:EORTC Head and Neck Cancer Cooperative Group[J]. J Natl Cancer Inst, 1996,88:890.

[2]Cheng CC, Yang SM, Huang CY, et al. Molecular mechanisms of gin-senoside Rh2-mediated G1 growth arrest and apoptosis in human lung ade-nocarcinoma A549 cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2005,55(6):531.

[3]Brown JM, Attardi LD. The role of apoptosis in cancer development and treatment response[J]. Nat Rev Cancer, 2005,5(3):231.

[4]Damia G, Broggini M. Improving the selectivity of cancer treatments by interferingwith cell response pathways[J]. Eur J Cancer, 2004, 40(17):2550.

[5]Radulovic S, Tesic Z, Manic S. Trans-platinum complexes as anticancer drugs:recent developments and future prospects[J]. Curr Med Chem,2002,9(17):1611.

[6]孟　艳,周桂华,李　扬,等.人参单体皂甙Rh2增强顺铂对PC-3M致凋亡效应的研究[J].中国病理生理杂志,2003,19(5):689.