人参皂苷Rh2诱导HL-60细胞凋亡的分子调控机制

　　摘要

　　人参皂昔Rh2系具有广谱抗肿瘤活性的单体化合物，但对其抗肿瘤作用的分子调控机制，特别是非器官特异性抗肿瘤作用的机制还不甚清楚。本研究以HI,-60细胞系为模型，选择能明显诱导HL-60细胞凋亡的最适剂量25μmol/L G-Rh2 ( ICso)作用HL-60细胞48 h,运用基因芯片和蛋白质组技术，并结合生物信息学方法，从转录本组和蛋白质组水平全面研究G-Rh2抗肿瘤作用的信号转导通路和分子调控网络，以深入探讨G-Rh2抗肿瘤作用的分子机制。

　　结果显示:(1) 25 μmol/I, G-Rh2 ( ICso)能明显诱导HL-60细胞480个肿瘤基因表达谱芯片中76个基因差异表达改变。其中表达上调基因16个，表达下调基因60个。差异表达上调最明显是TNF-a转录本，为对照组的9.0349倍;GeneMAPP软件对基因表达谱差异表达数据分析发现，主要与G-Rh2诱导凋亡的基因表达网络发生改变有关;< 2 ) Western blotting和TNF-a特异抗体中和实验显示，G-Rh2均能显著诱导多种肿瘤细胞系中TNF-a的过表达，且TNF-a特异抗体亦能明显拮抗G-Rh2诱导的HL-60细胞凋亡和凋亡效应关键分子Capase3、Capase8和Capase9活性;(3)双向凝胶电泳分析显示，G-Rh2能诱导HL-60细胞的蛋白质表达谱改变。通过对筛选的13个差异表达蛋白点进行质谱分析鉴定，发现表达上调最明显的是凋亡诱导分子一钙网蛋白，系TNF-a调控的下游靶蛋白。

　　结果表明:(1) G-Rh2可通过特异诱导TNF-a过表达，进而激活Caspase 8/Caspase 3外源性凋亡通路及Caspase 9/Caspase 3内源性凋亡通路，诱导HL-60细胞凋亡。同时G-Rh2通过激活TNF-a，上调钙网蛋白表达，进而改变细胞内Cat+稳态，发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用。但p21蛋白不参与G-Rh2诱导的HL-60细胞凋亡及TNF-a信号转导通路;(2 ) G-Rh2能明显诱导肿瘤细胞系 HL-60, K562, A549,MCF7中TNF-a的过表达，TNF-a信号转导通路可能是介导G-Rh2诱导肿瘤细胞凋亡的主要信号转导途径之一。

　　关键词:人参皂昔Rh2, HL-60/K562/A549/MCF7细胞，转录组，TNF-a，细胞凋亡，信号转导，蛋白质组

　　前言

　　人参(Panax ginseng C. A. Meyer)是我国传统名贵药材，在日本、韩国等远东地区国家，其应用也有着悠久的历史。据我国中医典籍记载:其性微温，味甘微苦，归脾、肺、心经，具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智之功效。现代生物医学研究方法发现，人参的药理活性范围十分广泛，不仅对中枢神经、心血管、免疫、内分泌系统具有药理作用，还表现出抗肿瘤、抗应激、抗氧化活性。

　　人参皂昔(ginsenoside)是人参中的主要活性成分，目前已分离鉴定出60余种皂营单体。根据人参皂昔昔元的结构类型、糖基的数量和位置可分为三类:达玛烷型(Dammarane)，齐墩果烷型(Oleanane)，奥克梯隆醇型(Ocotillol) 。

　　随着人类寿命普遍的增加，及生活环境和生活方式等改变，癌症越来越成为一个世界性的健康问题。据世界卫生组织统计，每年世界有超过一千万的癌症病例。抗肿瘤药物研究是肿瘤防治研究最活跃的领域之一。抗肿瘤药物的数量虽多，但理想的药物数量却很少。长期以来，为了克服细胞毒类抗肿瘤药选择性差，毒性大的弊端，研究人员一直努力寻找能特异识别并杀伤肿瘤细胞的药物。近年来，随着肿瘤细胞分子生物学的迅速发展，从分子、细胞水平上对恶性肿瘤细胞的异常增殖、浸润和转移等机制有了进一步的认识，针对肿瘤发生、发展机制的分子靶点治疗药成为研究的热点，人们开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗即“靶向治疗”。分子靶向治疗是通过着眼于阻滞特定的靶分子而达到抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，它有别于传统的细胞毒药物治疗是在于其具有非细胞毒性和靶向性。即以肿瘤细胞的特性改变为作用靶点，在发挥更强的抗肿瘤活性的同时，减少对正常细胞的毒副作用。2001年问世的新药甲磺酸伊马替尼((imatinib)，又名格列卫(Gleevec)，苯胺哦陡衍生物，能特异性地与费城染色体(Ph-chromosome) bcr2-abl融合基因产物的ATP位点结合，为BCR-ABL, KIT和PDGFRβ (platelet derived growth factor receptor-β)酪氨酸激酶的特异抑制剂。伊马替尼对慢性粒细胞性白血病((CML)近期疗效很好，可使98%的CML患者获得血液学缓解。伊马替尼被视为是一种“理想”的靶向药物，具有“里程碑”意义。

　　人参皂昔Rh2 (ginsenoside Rh2, G-Rh2)为达玛烷二醇型人参皂昔，有研究报道G-Rh2能够阻止致癌原引发的肿瘤形成[s]。大量的体内体外实验证实G-Rh2具有抗肿瘤的药理活性。研究显示，对各种组织来源的肿瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、畸胎瘤以及白血病G-Rh2都有抑制增殖作用，表明G-Rh2具有非器官特异性的广谱抗肿瘤作用。同时，由于其低毒性，并且与其它抗肿瘤药物存在协同作用，有望成为一种有效的抗肿瘤药物。

　　人参皂昔Rh2的抗肿瘤作用最终表现细胞周期阻滞和凋亡。研究发现，参与细胞周期调节的正性和负性调节因子介入其中。在大多经G-Rh2处理的肿瘤细胞，出现cyclinD 1，cyclinD3，cyclinE, cdk6表达下调，cyclinE/cdk2活性降低，而细胞周期抑制蛋白P27kip, P21WAFI/CIPIl, P16INK4a上调。G-Rh2诱导的凋亡与bcl-2无关，牵涉到调亡的执行分子Caspase。 Caspase3通过剪切PRPP, P21 WAFI/CIPIl，并可能在PKC s的参与下介导细胞的凋亡。近来，文献报道Rh2诱导的肺腺癌A549细胞凋亡发现了DR4表达上调。这为揭示Rh2的低毒性提供了线索，也为Rh2成为待开发的抗肿瘤药物提供了希望。

　　基于G-Rh2的广谱抗肿瘤作用，是否存在一种共同的药靶蛋白介导的信号通路，以发挥其非器官特异性抗肿瘤效应?迄今仍不清楚，亦未见研究报道。

　　由于细胞的行为最终由其遗传背景决定，研究药物处理后基因表达的改变有利于探明根本的作用机制和证实抗肿瘤药的药效和安全性。DNA微阵列(pNA microarray)技术，又称为基因芯片技术，作为监测基因表达的有力工具产生于90年代中期。其突出特点在于能够对样本中的基因表达信息进行快速、高通量的检测和分析。目前基因芯片已应用于多个研究领域中，特别是在肿瘤研究中的应用，更受到了广泛重视。肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，往往是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致，基因芯片技术以其快速、准确的特点，大大加速了抗肿瘤药物的前期基础性研究，为其从传统的细胞毒性药物向针对新靶点的新型抗肿瘤药物的发展提供了强有力的研究工具。

　　尽管基因芯片可以提供细胞内mRNA表达的信息，然而最终调节和介导细胞功能的不是mRNA，而是由mRNA翻译的蛋白质。仅仅依靠基因水平分析是不够全面的。“基因组告诉你理论上能够发生什么，mRNA告诉你可能发生什么，而蛋白质组告诉你正在发生什么”。蛋白质的表达也不能完全由mRNA的水平推断，转录和蛋白质水平并非必然地相关。一个基因的表达和其最终表达(即大量的蛋白质产物)间并没有绝对确定的关系。要从分子水平了解疾病就必须重视蛋白质表达的研究，对蛋白质的研究更能揭示疾病的本质，而直接或间接影响蛋白质是多数药物的作用机制，甚至很多药物本身就是蛋白质。而使用蛋白质组学方法探讨和阐明药物处理前后的细胞蛋白表达谱的变化，能更直接准确的发现和鉴别药靶，阐明药物作用的分子机理。但是蛋白质组学技术仍存在许多缺陷。目前，低丰度，难溶性蛋白，大分子蛋白难以被检测等技术问题还没有得到很好地解决。而基因芯片技术不存在这些问题。因此，基因芯片技术和蛋白质组学技术存在互补。同时运用这两项技术监测药物作用的细胞的转录本组和蛋白质组的改变，将更为准确和全面的阐明药物的作用机理。

　　本课题组前期研究以HL-60细胞系为模型，应用MTT比色试验，流式细胞术、DNA片段化试验、RT PCR, Western blot等方法，从细胞与分子水平研究初步阐释了人参皂昔G-Rh2对HL-60细胞系抑制增殖及诱导凋亡的作用，确定G-Rh2对HL-60细胞系的ICso为25 μmol/L;并初步探讨了G-Rh2抗肿瘤作用的分子机理。在此基础上，我们应用肿瘤基因芯片与蛋白质组学技术，更深层次上探讨G-Rh2广谱抗肿瘤作用信号通路的分子机制。希望通过对G-Rh2的分子机理的阐明，促进G-Rh2抗肿瘤药物的开发和临床应用。

　　技术路线

　　1 .用cDNA微阵列分析G-Rh2诱导HL-60细胞凋亡的信号转导通路

 

　　2. TNF-a在介导G-Rh2诱导HIr60细胞凋亡中的作用

　　2.1 Western blot分析G-Rh2在多种肿瘤细胞系中上调TNF-a的表达

 

　　2.2 TNF-a在G-Rh2诱导HL-60细胞凋亡中的作用

 

　　3. G-Rh2对HL-60细胞蛋白质表达谱的影响

 

　　第一章用cDNA微阵列分析G-Rh2诱导HL-60细胞凋亡的信 号转导通路

　　1 .1材料与方法

　　1 .1.1细胞系

　　人急性早幼粒白血病HL-60细胞系由本室保存。

　　1.1.2主要试剂

　　20(S)G-Rh2购自吉林大学化学系;dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Oligo(dT),Trizol试剂盒购自Invitrogen公司;RPMI 1640培养基购自Hyclone公司;小牛血清为本校产品;琼脂粉购自Takara公司:二甲亚}1,(DMSO), DEPC购自上海生工生物工程公司;AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Tay酶购自Promega公司;无RNA酶水，20XSSC溶液、10% SDS溶液实验室配制;TrueLabeling-AMP线性RNA扩增试剂盒，Biotin-l6-dUTP (Roche); SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒，化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit (SuperArrayBioscience) 。

　　1.1.3基因芯片

　　人肿瘤基因芯片Oligo GEArray(美国生物芯片有限公司)。

　　1.1.4实验仪器与软件

　　CO2细胞培养箱((Heraeus, German)，超净工作台((Heal force，上海申力科学仪器公司)，倒置显微镜(Olympus } Japan)，离心机((Eppendorf, German)凝胶成像仪(Pharmacia Biotech), PCR仪(Biometra} Germany)，垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，半干转膜仪(Bio-Rad), E960酶标仪(ERMAINC)} HB-1000 UVP杂交炉，G26SSAA Agilent扫描仪，G2938B Agilent 2100 Bioanalyzer, GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite )。

　　1.1.4实验方法

　　1.1.4.1细胞培养

　　人白血病细胞系HL-60常规培养在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，37℃，5% C02条件下培养，传代或用于实验。

　　1.1.4.2基因芯片分析

　　1.1.4.2.1 RNA抽提

　　(1)匀浆:离心沉淀细胞。加入Trizol试剂反复吹打使细胞裂解。每5 X 106的细胞使用1 mL Trizol试剂。

　　(2)两相分离:匀浆后样品于室温孵育5 min，每1 mL的Trizol试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15s后，室温孵育S min o 4℃，12,000 g离心15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。

　　(3) RNA沉淀:将水相转移到新离心管中。每加入1 mL Trizol试剂的加0.5 mL的异丙醇。混匀后室温孵育10 min后，于4℃12,000 g离心10 min。离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

　　(4) RNA清洗:移去上清液，每1 mL Trizol试剂匀浆的样品中加入1 mL的75%乙醇，4 0C，7,500 g离心5 min 。

　　(5)去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀10 min，重新溶解RNA沉淀。

　　1.1.4.2.2 RNA质量检测

　　(1)紫外吸收测定法

　　RNA溶于40 }L DEPC水中，取5 uL. 1:100稀释至495 }L的TE中，测得A260 ,再根据公式计算浓度。同时检测RNA溶液的A260/A280的比值。

　　(2)变性琼脂糖凝胶电泳

　　a.制胶:1g琼脂糖溶于72 mL水中，冷却至60℃，10 mL的10 X MOPS电泳缓冲液和18 mL的37%甲醛溶液。

 

　　灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 }.L溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 X MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

　　b.准备RNA样品:取3 },g RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10}留mL。加热至70℃孵育15 min使样品变性。

　　c.电泳:上样于胶孔中，5 V/cm电压下电泳至澳酚兰指示剂进胶至少3 cma

　　d.紫外透射光下观察并拍照。

　　1.1.4.2.3 cDNA标记与合成

　　(1) cDNA合成:

　　a.配制退火混合液:每个RNA样品均如下配制于一个灭菌的PCR管中:

 

　　用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。70℃水浴10 min后立刻放于冰中。

　　b.配制cDNA合成混合液:每种试剂均先离心至管底，置冰中待用。

　　如下表在离心管中依次加入:

 

　　用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。置于冰上待用。

　　c.cDNA合成反应:每10 μL退火混合液中加入10 μL的cDNA合成混合液。移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。42℃水浴50 minx短暂离心使液体聚集于管底。

　　(2) cDNA合成，标记和扩增:

　　a.配制扩增混合液:试剂盒中所有管溶解后离心溶液至管底，G4管中含有沉淀，37℃水浴溶解并吸打均匀，所有试剂均置冰中待用。

　　如下表在离心管中依次加入:

 

　　移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。

　　b. cDNA第二链合成反应:上一步反应中得到的于37℃水浴的20 μL cDNA合成反应终溶液中，分别加入20 }L扩增混合液。吸打混匀并离心至管底。37℃水浴4 h。

　　1.1.4.2.4 cDNA纯化:

　　(1)配制cDNA样品:

　　a.每个cDNA反应液中加入60 μL无RNA酶的水至总体积为100 μL。全部100μL反应液转移至1.5 mL无RNA酶的管中，冰中保存。

　　b。每个反应液中加入350 μL裂解结合缓冲液(G6)，用枪吸打几次以混匀，立刻进行下一步操作。

　　c.加入350 }L室温保存的无水乙醇，吸打5-6次以混匀。

　　(2) cDNA结合至纯化柱上:

　　a.每个样品分别加入纯化柱的中心。

　　b.将纯化柱放入收集管中，8,000 g离心30 so

　　c.取下纯化柱，丢弃流出的液体，纯化柱放回收集管。

　　(3)清洗纯化柱:

　　a.每个纯化柱中加入600 },L工作液。

　　b. 8,000 g离心约30 s，确保所有洗液通过柱子滤出。

　　c.取下纯化柱，丢弃流出的液体，将纯化柱放回收集管。

　　d.每个纯化柱中再加入200 }L工作液。

　　e. 11,000 g离心3 min，确保所有洗液通过柱子滤出。

　　(4) cDNA从纯化柱中洗脱:

　　a.将纯化柱转入新的洗脱管，确认柱子的末端未触碰到任何流出的液体。

　　b.每个纯化柱的中心加入50 }L室温放置的除RNA酶的H20 0

　　c.室温放置2 min o

　　d. 8，000g离心1 min，确认所有溶液通过柱子。得到的溶液即纯化的。DNA

　　保存于冰中。

　　1.1.4.2.5芯片杂交

　　(1)预杂交:

　　a.加约SmL去离子水于杂交管中预湿芯片膜，拧紧管盖倒放5 min o

　　b. 60℃预热GEAhyb杂交液，多次颠倒试剂瓶以彻底溶解瓶中组分。

　　c.去除杂交管中的水，加入2mL预热的GEAhyb杂交液，转动管子。

　　d.将杂交管放在杂交炉中，旋紧盖子。加热后检测杂交管盖是否仍然密封。以转速10 rpm 60℃预杂交2 h。

　　(2)杂交:

　　a.配制样品杂交液:加入20pg用TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素

　　标记的cRNA样品至0.75 mL预热的GEAhyb杂交液中，混合均匀放于60℃。

　　b.弃去杂交管中的预杂交液，加入含有标记的cRNA的样品杂交液。

　　c.于60℃保持5到10 rpm旋转杂交过夜。

　　(3)洗膜:

　　a.每张芯片需配制5 mL的洗液1和5 mL的洗液2。洗液1: 2XSSC} 1%SDS。洗液2: 0.1 X SSC} 0.5 % SDS。洗液1和洗液2使用前预热至60 ℃。

　　b.转移杂交管中的样品杂交液于一干净的离心管中，-20℃保存以便用于其它芯片杂交。

　　c.加入5 mL洗液1至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃30rpm转动洗膜15 min。弃去洗液。

　　d.加入5 mL洗液2至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃30rpm转动下，洗膜15 min。立刻弃去洗液，盖上杂交管盖以保持膜湿润，冷却至室温。

　　1.4.2.6化学发光检测

　　(1)膜封闭:

　　最后一次洗膜后，弃去洗液，立刻加入1.5 mL GEAb封闭液Q，在杂交仪中30 rpm孵育40 min o

　　(2)加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP):

　　配制1X缓冲液F:用水将SX缓冲液F稀释5倍。每杂交管准备18mL的1X缓冲液F。配制结合混合液:AP:1 X缓冲液F(1:7,500)混合。每杂交管配制2mL结合缓冲液。弃去杂交管中的GEA封闭液Q，加入2 mL结合缓冲液，在杂交仪中轻轻摇动孵育10 min。

　　(3)洗膜:

　　洗膜4次:加入4mL的1X缓冲液F温和振荡5 min，弃去1X缓冲液F。加入3mL缓冲液G温和震荡S min;倒掉，再用3mL缓冲液G重复洗一次。

　　(4)检测:

　　加入1.0 mL CDP-Star化学发光底物至杂交管中，室温孵育2 min。取出膜，放在一张滤纸上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用干净的塑料膜两面包住，驱除气泡，用X一射线胶片曝光。

　　1.1.4.2.7图象采集和数据分析

　　(1)图像采集

　　使用CDP-Star孵育过后，芯片即用于图像采集。化学发光的芯片图像通过X胶片和台式扫描仪获得。

　　(2)数据分析

　　图片保存为灰度16 bit的电子版文档，TIFF格式文件。使用网上提供的综合型GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。

　　1.2结果

　　1.2. 1 RNA质检

　　总RNA吸光度A260 / A280≈1.8，电泳28S / 18S≈2，说明RNA纯度较高，完整性较好，见图1-1.

 

　　2.2芯片杂交

　　应用包含480个肿瘤相关基因的人寡核甘酸基因芯片，按阳性标准，从480个寡核甘酸片断中筛选出76个差异基因(Ratio>=2或<<=0.5. Flags为P. S/N>2 ) 。经半数抑制剂量((ICso) 25 },mol/L G-Rh2处理后的HL-60细胞，共有76个基因表达明显改变，有16个基因表达上调，60个基因表达下调。其中表达改变最明显的为肿瘤坏死因子TNF-a，表达上调达9.0349倍(图1-2，表1-lA)。图1-2为对照与25 }mol/L G-Rh2处理的芯片化学发光标记图，表1-lA为上调基因列表，表1-1B为下调基因列表。

 

 

 

 

 

　　1.2.3 GeneMapp软件对基因芯片中差异表达基因的信号转导通路分析

　　我们使用Pathway分析软件GenMAPP来整合基因表达数据。见图1-3A,B,C。图1-3 A凋亡通路图可见，主要的外源性凋亡通路的组成成分:T'NF-a,TNFRSF 1 OB表达升高，外源性凋亡通路被激活。

 

　　由图1-3 B，细胞周期调控通路图中，我们看到细胞周期的负调节分子CDKNIA, CDKNIB表达上调。检测点调节分子Wee 1表达上调。

 

　　由图1-3 C . Ras/MAPK信号级联途径MAPP中，可以看到Ras家族的三个成员H-ras, K-ras和N-ras在芯片均表达下调。

 

　　1.3讨论

　　基因芯片(Gene Chip)又被称为DNA芯片(DNA chip), DNA微阵列(DNA microarray)等。世界上第一个基因芯片是定量研究拟南芥((Arabidopsis thaliana)基因表达的cDNA微阵列。在此之后国际上掀起了一阵基因芯片设计的热潮，出现了多种类型的DNA芯片技术。在短短几年时间内基因芯片技术不断完善，现已在基因序列分析、基因诊断、基因表达研究及在疾病诊断和治疗、新药研究和开发等领域中显现出非常广阔的应用前景。

　　肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，往往是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致，虽然己经有许多有效的抗肿瘤药物，但如何寻找特异性高、作用强的新药物并研究其作用机理，传统技术方法仍存在局限性。采用基因芯片的研究方式无疑具有巨大的优越性，它可以进行多靶位、同步高通量药物研究。该技术允许在对化合物作用机理细节不够了解的情况下，暂时忽略化合物作用的详细及复杂的过程，直接从化合物对基因的作用方式中比较基因表达的异同，从而找出化合物作用后特异的基因表达谱，并由此建立相关化合物的数据库。当数据积累到足够多时，就可将一种未知性质的新化合物的图谱与已知药物作用后的基因表达谱进行比较，并预测其属于哪一种药物作用类型。在此初筛基础上，可进一步通过实验直接证实药物的作用方式及机理。这种研究方式比传统的药物研究方法更简单、省时，并且这种研究的优点就是可以在分子水平上了解其作用特点及机理。式比传统的药物研究方法更简单、省时，并且这种研究的优点就是可以在分子水平上了解其作用特点及机理。

　　为了寻找G-Rh2抗肿瘤作用的信号通路和靶分子，我们应用包含480个肿瘤相关基因的人寡核甘酸基因芯片来监测G-Rh2作用HL-60细胞后基因表达的变化。25 }mol/L G-Rh2作用HL-60细胞48 h后，基因芯片结果显示，根据筛选标准，共有76个基因的表达发生明显改变。其中，16个基因表达上调，60个基因表达下调。结果见表1A, 1B。这些差异表达的基因主要涉及细胞周期、凋亡、细胞因子、免疫以及代谢。其中表达上调最明显的为肿瘤坏死因子TNF-a，表达上调达9.0349倍。

　　目前，用来分析基因芯片结果的方法包括根据相似的表达模式进行基因聚类的unsupervised methods如hierarchical and K-means clustering;和dimensionality-reduction methods如self-organized maps。尽管这些方法描叙基因表达的改变是有效的，但在对基因信息的了解有限的情况下用来描叙细胞反应具有局限性。近来，Pathway分析(也称为functional enrichment功能富集)逐渐成为一种分析基因芯片通行的方法。这种方法整合标化的芯片数据和它们的注解，将其按照涉及的信号通路与基因本身的功能信息进行分类。

　　GenMAPP软件是由加州大学旧金山分校Gladstone研究所开发的分析软件，被许多研究者报道应用于Pathway分析。

　　我们首先选取了凋亡的MAPP来进行Pathway分析。如图1-3 A。从凋亡通路图，我们发现外源性凋亡通路被激活。主要的外源性凋亡通路的组成成分:TNF-a ,TNFRSF 1 0B表达升高。TNF信号通路的激活较为明显TNFRSF 10B为TNF受体超家族成员，又称死亡受体5 ( Death Receptor 5 , DRS )，是介导细胞凋亡的重要受体分子，在芯片中上调1.536倍。RELA分子是NF- K B的亚单位，在芯片中下调至对照组的0.3801倍。NF-xB是一种十分重要的转录因子，被原癌基因，病毒蛋白，致癌原，炎症刺激等多种刺激激活。NF-xB的激活调控大量的基因表达。

　　细胞周期的调控可分为外源性和内源性调控，外源性调控主要是由外界刺激引起的。而内源性调控主要是通过细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)、细胞周期蛋白激酶抑制因子(cyclin kinase inhibitor, CKI)进行网络调控来实现fuel。随着CDKs的分离以及一系列CDK抑制物((CKIs)如p16INK4, p21WAF1, p27KIP1等的发现，细胞周期的研究己取得了突破性的进展。细胞周期有3个检测点((check point)，即G1/S检测点、G2/M检测点和纺锤体组装检测点。其中以G1/S检验点最为重要。在G1期发挥作用的主要是cyclin D及其结合分子CDK4和CDK6oCDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以与cyclin结合的复合物形式出现，该复合物分为催化亚基和调节亚基两部分。高等动物的细胞周期蛋白有A, B, C, D, E, F, G和H等。其中cyclin C, D, E只在G1期表达，称为G1期周期蛋白，它们在G1期和G1/S交界处发挥作用，启动细胞周期并能促进DNA合成。

　　从图1-3 B，细胞周期调控的MAPP中，我们看到细胞周期的负调节分子CDKNIA, CDKNIB表达上调。周期蛋白依赖激酶抑制因子1A (CDKNIA,p21WAFI/ICPIt)和周期蛋白依赖激酶抑制因子1B (CDKNIB, p27KIPI)都是CDKs活性的负调控因子。两者在芯片中分别上调3.0299倍和2.3654倍。p21WAFI/ICPIt可广泛结合cyclin-CDK复合物，包括A, B, D, E型cyclin与CDC2, CDK2, CDK4,CDKS形成的复合物，抑制CDKs激酶活性; p27KIP，可与cyclinD, cyclinE,CDK4, CDK2结合，抑制CDK2-cyclinD, CDK2-cyclinA活性，主要在细胞周期G1和G1/S阶段发挥负调控作用。Wee 10为细胞周期正调控蛋白，在细胞周期中，Wee 1通过调控G2/M期的检测点，以确保细胞进入有丝分裂前完成DNA复制和DNA损伤修复。其在芯片中上调，考虑为对CDKN 1 A和CDKN 1 B上调的代偿。

　　Ras/MAPK信号转导途径是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的重要信号途径。多肤生长因子与受体结合，激活下游信号分子如Ras、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)等，通过级联酶促反应，影响基因表达，调控细胞增殖和分化与凋亡。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases MAPKs)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，与细胞增殖、分化或凋亡调控密切相关，是生物体内重要的信号转导系统之一。它包括了一系列蛋白激酶的级联反应:Ras与GTP结合后被激活，使Raf募集到细胞膜并与之结合，随后MEK, MAPK依次被磷酸化激活，MA.PK活化一些转录因子、蛋白激酶等，引发多种生物学效应。另外，Ras/GTP还可以通过MEKK来活化MEK。 Ras家族为该通路上游的重要分子，通过激酶级联效应促进细胞有丝分裂、增殖。

　　从图1-3 C ， Ras/MAPK信号级联途径MAPP中，可以看到lzas家族的三个成员H-ras, K-ras和N-ras在芯片中分别下调至对照组的0.495倍、0.439倍、0.406倍。H-ras, K-ras和N-ras均为重要的原癌基因，具有类似的结构和序列，有五个外显子，其中第一个不参与编码，其后四个外显子编码Ras蛋白质。三种Ras蛋白质在前165个氨基酸几乎相同，在C端区域有数个氨基酸的差异，ras的过度表达与肿瘤的发生十分密切，通过促进细胞有丝分裂、增殖，抑制凋亡的途径促进肿瘤的发生、发展。G-Rh2可能通过下调Ras的表达，抑制Ras/MAPK信号级联途径，起到抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡的作用。

　　综上所述，G-Rh2可通过激活TNF凋亡信号通路、细胞周期G1期的负调控作用，抑制Ras/MAPK信号级联途径，发挥抗肿瘤效应。

　　第二章 TNF-a在介导G-Rh2诱导HL-60细胞凋亡中的作用

　　2.1材料与方法

　　2.1.1细胞系

　　人急性早幼粒白血病HL-60细胞系，人红白血病K562细胞系、人肺腺癌A549细胞系、人乳腺癌MCF7细胞系均为本室保存。

　　2.1.2实验试剂

　　20(S)G-Rh2购自吉林大学化学系，经高效液相色谱鉴定纯度为98.7%; RPMI 1640培养基购自Hyclone公司;小牛血清为本校产品;琼脂粉购Takara公司;二甲亚矾(DMSO), DEPC购自上海生工生物工程公司;无RNA酶水，20xSSC溶液、10% SDS溶液实验室配制;Anti-TNF(羊抗人多克隆抗体)，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG二抗，ECL发光试剂购自Santa Cruz公司;Anti-GAPDH(羊抗人多克隆抗体)购自Abcam公司;TNF-a中和抗体(羊抗人多克隆抗体)购自Peprotech公司;BCA蛋白质定量试剂盒，预染的蛋白质Marker购自Pierce Chemical公司;PVDF膜购自Millipore公司;Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9分光光度法检测试剂盒购自凯基生物公司。

　　2.1.3实验仪器与软件

　　CO2细胞培养箱(Heraeus, German)，超净工作台((Heal force，上海申力科学仪器公司)，倒置显微镜(Olympus, Japan)，离心机((Eppendorf, German),凝胶成像仪(Pharmacia Biotech), PCR仪((Biometra, Germany)，垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，半干转膜仪(Bio-Rad), E960酶标仪(ERMAINC)，统计分析软件SPSS 13. 0。

　　2.1.4实验方法

　　2.1.4.1细胞培养

　　人白血病细胞系HL-60、人红白血病细胞系K562、人肺腺癌细胞系A549,人乳腺癌细胞系MCF7均常规培养在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，37℃，5% C02条件下培养，传代或用于实验。

　　2.1.4.2抗体中和试验

　　细胞培养于12孔板，分为三组:不用任何处理的细胞对照组;25 μmol/L

　　G-Rh2处理组;25 μmol/L G-Rh2与0.5 mg/L TNF-a中和抗体联用组。每孔接种HL-60细胞2 X 105/mL 2.5 mL，每组接种2孔。处理24 h, 48 h, 72 h收集细胞，