人参皂苷单体Rh2促使人脑胶质瘤U251细胞凋亡的实验研究

　　人参皂苷单体Rh2 促使人脑胶质瘤U251 细胞凋亡的实验研究

　　摘要:目的:观察人参皂苷单体Rh2 ( GS-Rh2 ) 诱导人脑胶质瘤U251 细胞的凋亡作用，进而探讨其对端粒酶活性影响和人端粒酶逆转录酶( hTERT) 表达的机制。方法:人脑胶质瘤U251 细胞经GS-Rh2 处理后，采用MTT 法检测细胞抑制率，免疫荧光技术观察凋亡小体，流式细胞仪经Annexin V-FITC/PI 双染法观察细胞凋亡，TRAP-ELISA 法检测端粒酶活性改变，通过RT-PCR 技术检测hTERT 基因的表达。结果: GS-Rh2 对U251 细胞具有抑制作用，呈明显的剂量依赖关系，免疫荧光技术观察到凋亡小体的出现，流式细胞仪检测GS-Rh2 引起U251 细胞凋亡并与药物浓度存在依赖关系，TRAP-ELISA 法发现GS-Rh2 可以降低端粒酶活性且呈剂量和时间依赖关系，RT-PCR 证实GS-Rh2 可降低hTERT 基因的表达。结论:人参皂苷单体Rh2 能够诱导人脑胶质瘤U25l 细胞发生凋亡，并抑制和降低细胞端粒酶活性，经过RT-PCR 证实GS-Rh2 作用于胶质瘤的分子生物学机制可能与抑制胶质瘤细胞hTERT 基因有关，进而诱导细胞发生凋亡。

　　关键词:人参皂苷单体Rh2 ;胶质瘤;细胞凋亡; hTERT; mRNA

　　人参为五加科多年生草本植物，是一种有着近几千年应用历史的名贵中药。人参皂苷单体Rh2 是从人参中提取的天然活性成分，它是在鲜人参加工成红参过程中，某些原人参二醇组皂苷受热降解后生成的次皂苷。国外研究表明，GS-Rh2 的抗肿瘤作用较为广泛，在肿瘤的预防和治疗方面具有较强的活性，具有抑制肿瘤的生长和诱导癌细胞凋亡的作用。为了进一步研究GS-Rh2 对肿瘤细胞的作用机制，我们以人脑胶质瘤U251 细胞株为实验材料，在体外探讨GS-Rh2诱导人脑胶质瘤U251 细胞发生凋亡的机制，从而为该药临床的应用提供实验基础和理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　GS-Rh2 购自吉林省宏久生物科技股份有限公司，DMEM 培养基购自美国Gibico 公司; 胎牛血清购自杭州四季青工程材料有限公司; MTT、丫啶橙、DMSO、RT-PCR 试剂盒、Annexin V-FITC /PI 双染试剂盒等均购自大连宝生物工程有限公司; TRAP-ELISA

　　试剂盒购于北京中杉公司; 酶联免疫检测仪、荧光倒置显微镜、PCR 仪、Biorad 凝胶成像系统、三恒多功能电泳仪、流式细胞仪( 美国) 。

　　1.2 人脑胶质瘤细胞株

　　人脑胶质瘤U251 细胞购自中科院上海细胞库，细胞培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2 及饱和湿度的培养箱中进行细胞培养传代，取对数生长期细胞进行实验研究。

　　1.3 方法

　　1.3.1 MTT 法检测细胞增殖抑制率取对数生长期胶质瘤U251 细胞接种于96 孔培养板( 细胞数为1 ×104 /孔) ，加入配制好的GS-Rh2，使其终浓度分别为0、5、10、20、40、80 μg /mL，每孔设4 个复孔，最后用新鲜培养基补充至每孔100μL，37 ℃、5% CO2 孵箱中培养48 h 后，改用不加胎牛血清的培养基继续培养4 h，然后每孔加入MTT 溶液( 5mg /mL) 20μL 孵箱培养4 h后弃去孔内的MTT，每孔加入150μL DMSO，37 ℃温度充分震荡10min，酶联免疫检测仪570nm 波长处测定吸收度A 值。抑制率= ( 1 -加药组A 值/对照组A值) × 100%。绘制细胞增殖抑制曲线求出IC30、IC50、IC70 值时的药物浓度。

　　1.3.2 丫啶橙荧光染色观察调亡细胞形态学变化收集IC50 浓度GS-Rh2 作用48 h 的胶质瘤U251 细胞，采用95%乙醇固定标本，1%醋酸酸化30 s 后，用PBS 清洗1min，加入100μL 丫啶橙染色5min，再次用PBS 清洗1min，最后用0.1 mol /L CaCl2 分化2min，将盖玻片固定到载玻片上，在490nm 激光波长的荧光显微镜下观察细胞形态学变化。

　　1.3.3 流式细胞仪Annexin V-FITC /PI 双染法检测细胞凋亡取孵箱培养48 h 的对照组和实验组U251细胞，调整待测细胞浓度为1 × 106 个/mL，取1mL 细胞，1000r /min，4 ℃离心10min，弃上清，再加入1mL 的PBS，1000r /min，4 ℃离心10min，弃上清，反复操作3次，将细胞重悬于200μL Binding Buffer 中，加入10μLAnnexin Ⅴ-FITC 和5μL PI，混匀后避光4 ℃ 反应30min，最后加入300μL Binding Buffer，1h 内上流式细胞仪进行检测。

　　1.3.4 TRAP-ELISA 法检测端粒酶活性变化收集药物浓度为IC30、IC50、IC70 作用12、24、48、72 h 和对照组的U251 细胞，分别加入细胞裂解液200μL，取上清取上清液并根据试剂盒提供的引物和预设PCR 程序进行端粒序列扩增，将扩增产物顺序进行杂交、显色

　　处理后室温放置20min，最后加入反应终止液100μL，酶联免疫检测仪测450 nm 和690 nm 波长的OD 值。差值△A = OD450-OD690 代表细胞端粒酶活性。阴性对照采用胶质瘤U251 细胞提取液于65 ℃ 加热10min，△A < 0.2 为阴性，阳性对照以试剂盒提供的人胚肾293 细胞株端粒酶提取液为准，△A > I.5 为阳性。

　　1.3.5 RT-PCR 检测hTERT mRNA 的表达水平分别取对照组和GS-Rh2 浓度为IC50 作用24、48、72 h的U251 细胞，分别提取各实验组细胞总RNA，然后逆转录制备cDNA，产物进行聚合酶链反应。hTERT 引物: 上游，5’- CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA -3’; 下游，5’- GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3’，扩增235 bp。β-actin 引物: 上游5’- GGC ATG GGTCAG AAG GAT TCC-3’; 下游5’- ATG TCA CGCACG ATT TCC CGC-3’，扩增500 bp。PCR 反应条件: 94 ℃ 5min 后进入下列循环: 94 ℃ 30 s、62 ℃ 40s、72 ℃ 40 s，共39 个循环，72 ℃延伸7min 后终产物经1.8 %琼脂糖凝胶电泳成像系统拍照分析，利用图像分析软件GeneTools 分析各组hTERT、β-actin 两条基因条带的灰度比。

　　1.3.6 统计学处理采用SPSS 17.0 软件，数据采用( 珋x ± s) 表示，两样本均数比较进行配对t 检验，P <0.05，认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT 法计算GS-Rh2 对U251 细胞的抑制率由统计结果分析证实GS-Rh2 明显抑制细胞增殖，并且随着GS-Rh2 药物浓度的增加细胞受抑制程度明显增强( 表1) ，与对照组比较P < 0.05 有统计学意义。根据细胞增殖抑制曲线求得IC30、IC50、IC70值的GS-Rh2 作用浓度分别为9.7、25.2、68.4 μg /mL。

　　2.2 丫啶橙荧光染色观察调亡小体免疫荧光显微镜下观察到对照组细胞呈多角形、胞体舒展、胞核为黄绿色形态一致; GS-Rh2 作用48h后，细胞开始出现调亡现象，细胞形态明显不规则、体积变小、胞浆和胞核染色质出现凝集和碎片、可见核固缩、出现调亡小体( 图1) 。

　　2.3 流式细胞仪Annexin V-FITC /PI 双染检测细胞凋亡不同浓度GS-Rh2 作用于U251 细胞48h 后，从FITC 和PI 荧光双参数点图( 图2) 上发现，对照组细胞主要分布在左下象限的活细胞区，因操作等原因造成的细胞机械性死亡数量很少，而实验组细胞分布情况出现明显变化，与对照组比较随着药物浓度的加大，早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量也在逐渐增多。

　　2.4 TRAP-ELISA 法检测端粒酶活性变化在不同的浓度和作用时间情况下，U251 细胞经GS-Rh2 处理后端粒酶活性发生了明显变化( 表2) ，对照组在整个实验过程中无明显变化，P > 0.05 无统计学意义，与对照组相比，当浓度为IC30、IC50、IC70时药物分别作用48、24、12h 时，端粒酶活性出现降低的趋势，P < 0.05 有统计学意义，由此可见，GS-Rh2抑制胶质瘤U251 细胞端粒酶活性存在时间和剂量依赖性关系。

　　2.5 RT-PCR 检测人端粒酶催化亚单位hTERT mRNA的表达水平以胶质瘤U251 细胞RNA 为模板，经RT-PCR 技术扩增hTERT、β-actin 基因片段，通过1.8%琼脂糖凝胶电泳获得了hTERT 235bp 和β-actin 500bp 的扩增条带( 图3) 。通过图像分析软件GeneTools 分析结果表明实验组与对照组相比较扩增条带灰度比有显著性差异，并且随着作用时间的延长hTERT mRNA 表达量减少。

　　3 讨论

　　脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，目前手术切除是主要的治疗方法，但远期效果不理想。肿瘤主要发生机制之一是细胞正常的有限生命周期的缺陷，使细胞永生化，端粒酶的激活是细胞永生化的关键步骤。研究人员热衷于对端粒酶作为药物靶点进行研究的原因有二:第一是端粒酶在大多数肿瘤细胞中高表达，但在正常细胞中的表达则很少; 第二是因为肿瘤细胞中端粒的长度要远低于正常细胞，一旦选择性抑制端粒酶活性，则肿瘤细胞将比正常细胞更快死亡。端粒酶( Telomerase) 是位于细胞核内的一种逆转录酶。Kyo 等研究表明hTERT 是端粒酶活性的限制性成分，hTERT 的表达是端粒酶活性和肿瘤发展中的限速步骤。由此可见，hTERT 基因表达可以反映端粒酶活性与hTERT mRNA 表达水平，端粒酶激活可以使正常细胞走向无限增殖。端粒酶的活性表现是人端粒酶逆转录酶( hTERT)以人端粒酶RNA( hTR) 为底物合成端粒序列维持端粒在一定长度，稳定染色体结构，使细胞成为永生性细胞。hTERT 是维持端粒酶活性最重要的成分hTERT 基因位于染色体5p15.33，为40kb 的单拷贝基因，编码由1132 个氨基酸组成的127kD 蛋白，hTERT与端粒酶活性呈平行相关。研究证实，人胶质瘤中端粒酶hTERT 呈阳性表达，阳性率与肿瘤的恶性相关。从上述端粒酶、hTERT 与肿瘤生长和发展的关系来看，我们可以通过抑制hTERT 基因的表达，降低细胞的端粒酶活性，从而达到治疗肿瘤的目的。研究表明，相对于其他类型的抗肿瘤药物，肿瘤对于端粒酶抑制剂类药物不易产生耐药性。本实验以人脑胶质瘤U251 细胞株为材料，采用MTT、AO 荧光染色、流式细胞仪Annexin V-FITC /PI 双染、TRAP -ELISA 法测端粒酶活性、RT-PCR 检测基因表达的方法对GS-Rh2 作用后的U251 细胞进行实验研究。通过分析结果证实，在体外GS-Rh2 抑制人脑胶质瘤U251 细胞的增殖，并且随着药物浓度的增加细胞增殖程度明显降低，且呈明显的量效关系，IC50 为25.2μg /mL。丫啶橙荧光显微镜下观察到经GS-Rh2 处理后的U251 细胞出现典型的凋亡小体，细胞核及胞质呈现致密浓染的淡黄色，细胞体积变小，细胞膜完整，胞浆和胞核染色质出现凝集、可见核固缩。流式细胞仪检测细胞凋亡发现，各实验组细胞分布区域发生了明显变化，随着药物浓度增加活细胞区细胞数量逐渐减少，而早期凋亡、晚期凋亡或坏死区细胞数量相应增多。从而证实GS-Rh2 对人脑胶质瘤U25l 细胞有明显抑制作用，且以早期凋亡细胞数量尤为明显。绝大多数人类正常体细胞不表达端粒酶活性，而85% ～ 95%人类恶性肿瘤细胞以及体外培养的肿瘤细胞株都有端粒酶活性的强表达。因此恶性肿瘤的发生、发展及预后与细胞端粒酶的异常表达也有着密切关系。本实验通过TRAP-ELISA 法检测细胞端粒酶活性变化后发现，实验组随着时间延长和剂量加大端粒酶活性逐渐降低，并呈现时间和剂量依赖性关系，可以推断GS-Rh2 能够抑制hTERT 基因的表达，降低细胞端粒酶活性，导致胶质瘤细胞死亡，最终达到肿瘤治疗的目的。hTERT mRNA 水平与端粒酶活性密切相关，hTERT 的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是必需和足够的，hTERT 的表达是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤。本实验中获得的hTERT 基因扩增条带表明，GS-Rh2 能抑制hTERT mRNA 的表达水平，图像分析软件进一步表明实验组与对照组相比较扩增条带的灰度比存在显著性差异，并存在统计学意义，且随着药物作用时间的延长hTERT mRNA 的表达量越来越少。因此，我们可以利用hTERT 启动子的癌细胞相对特异的转录活性，作为肿瘤基因治疗的突破口。通过本实验的系统研究发现人参皂苷单体Rh2 是一种天然的抗肿瘤药物，对于临床肿瘤的治疗可发挥重要作用。