人参皂苷Rh2抗白血病多药耐药细胞K562/VCR作用研究

　　徐晓军 ,石淑文 ,汤永民,沈红强,钱柏芹

　　(浙江大学医学院附属儿童医院 血液肿瘤科 ,浙江省新生儿疾病诊治重点实验室 ,浙江 杭州 310003)

　　摘　要: 目的　通过观察人参皂苷 Rh2对人白血病多药耐药 MDR 细胞 K562/ VCR 生长、凋亡的作用和逆转耐药的情况 ,探索该药在抗人白血病 MDR 方面的应用价值。方法　将人参皂苷 Rh2 与 K562 、K562/ VCR 细胞共培养 48 h 后采用 M TT 法分析其对细胞生长的抑制率;将其与 K562/ VCR 细胞于 37℃孵育 30 min 后 ,采用 An nexin V 和 PI 双染法在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况;并观察其对 K562/ VCR 细胞摄取柔红霉素 DN R能力及细胞表面 P糖蛋白 Pgp表达的影响;在 DN R 与 K562/ VCR 培养体系中加入不同质量浓度人参皂苷 Rh2,孵育 48 h 后观察人参皂苷 Rh2 对 K562/ VCR 细胞耐药的逆转情况。结果 　人参皂苷 Rh2 可明显抑制 K562 和K562/ VCR 细胞的生长 ,并呈量效关系 ,人参皂苷 Rh2 对 K562 和 K562/ VCR的半数抑制浓度 ( IC50 ) 分别为445 、594μg/ mL 。K562/ VCR 经人参皂苷 Rh 在 37 ℃作用 30 min 后 ,细胞的凋亡明显增加 ,随人参皂苷 Rh 质量浓度的增加 ,凋亡细胞的比例明显增加[人参皂苷 Rh2 300μ g/ mL ,Annexin V 细胞 515 ±69 %] 。K562 细 胞经长春新碱 VCR诱导耐药后 ,Pgp 表达率明显提高 从 428 % 到 9380 %,DN R 摄取率减少 ,25μg/ mL以上质量浓度的人参皂苷 Rh2 即可明显提高 K562/ VCR 对 DN R 的摄取 ,但 Pgp的表达无明显改变。同时,它可明显提高 DN R 对 K562/ VCR 的杀伤率 ,50μg/ mL 人参皂苷 Rh2 可使 K562/ VCR 对 DN R 的敏感性提高到原来的 630 倍。结论　人参皂苷 Rh2 能抑制 K562/ VCR 细胞生长 ,诱导其凋亡 ,还可以逆转 K562/ VCR 的耐药 ,是一种具有广阔开发前景的抗白血病药物。

　　关键词:人参皂苷 Rh2 ; 多药耐药;白血病; K562/ VCR 细胞

　　Therapeutic effects of ginsenoside Rh2 on multidrug resistant leukemia cell line K562 / VCR

　　XU Xiaoj un , SH I Shuwen , TAN G Yongmin , SH EN Hongqiang , Q IAN Baiqin (Zhejiang Key Laboratory for Diagno sis and Therapy of Neonatal Diseases , Division of Hematologyoncology , Children′s Ho spital of Zhejiang Univer sity , School of Medicine , Hangzhou 310003 , China)

　　Abstract : Objective 　To study t he therapeutic effect s and t heir mechanisms of ginseno side Rh2 on multidrug resistance of (MDR) leukemic cells by ob serving t he effect s of ginseno side Rh2 on p roliferation , apopto sis , and resistance to Vincristine (VCR) of human eryt hroleukemia cell line K562/ VCR. Methods First , ginseno side Rh2 wit h different concentration was cocultured with K562 and K562/ VCR cells in 96 wells cell culture plates. The inhibitory rates and 50 % inhibitory concentration (IC50 ) were determined and calculated 48 h later by M T T assay . Second , ginseno side Rh2 with different concentration was cocultured wit h K562/ VCR cells in water bat h at 37 ℃for 30 min , t hen t he apopto sis rates were examined by Annex in V/ PI apopto sis kit on flow cytometry. Third , ginseno side Rh2 wit h different concentration was cocul tured wit h K562/ VCR cells in water bat h at 37 ℃for 30 min followed by adding Daunorubicin (DN R) after washing wit h PB S. The intake of DN R and t he exp ression of Pglycop rotein (Pgp) were analyzed 30 min later on flow cytometry. Finally , ginseno side Rh2 wit h different concentration was cocultured with K562/ VCR cells in 96 well cell culture plates , which were t hen treated by DN R. The inhibitory rates and rever se effect s were evaluated 48 h later by M T T assay. Results 　K562 and K562/ VCR cells′growth were obviously inhibited by ginseno side Rh2 in a do sedependent manner . The IC50 values of K562 and K562/ VCR were 44 . 5 and 59. 4μg/ mL , resp ectively. Ginseno side Rh2 could induce apopto sis of K562/ VCR [ Rh2 300 μg/ mL , Annexin V cell 51. 5 ±6. 9 %] . The apopto sis rate of K562/ VCR increased in accordance wit h t he rise of ginseno side Rh2 concentration . The exp ression of Pgp increased (4 . 28 % to 93. 80 %) and t he intake of DN R decreased when K562 was resistant to VCR. However , ginseno side Rh2 wit h a con centration of 25 μg/ mL or higher could greatly enhance the intake of DN R. The inhibitory effect s of DN R on K562/ VCR could be greatly increased by Rh2 . The rever se index was 6. 30 when Rh2 concentration was 50 μg/ mL . Conclusion 　Ginseno side Rh2 could inhibit t he growt h , induce the apopto sis , and rever set he MDR of K562/ V CR. It could be an excellent antileukemic agent .

　　Key words : ginseno side Rh2 ; multidrug resistance (MDR) ; leukemia ; K562/ VCR cells。

　　多药耐药性(MDR)是肿瘤化疗失败及肿瘤复发的重要原因。目前，至少发现13种与MDR相关的ATP结合盒转运体，MDR P-糖蛋白(简称P-gp)，是其中最重要的一员。维拉帕米，环孢霉素等常见的耐药逆转剂，由于正常血药浓度难以达到疗效或明显的不良反应而在应用上受到限制。而某些天然黄酮类化合物可逆转肿瘤细胞的MDR。人参皂苷Rh2是从红参中提取的天然成分，研究表明其可抑制小鼠黑色素瘤，胶质瘤及人肝癌，乳腺癌等肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡，逆转P-gp介导的细胞耐药。但人参皂苷Rh2对人白血病细胞作用有关资料尚不完善。本实验主要通过观察人参皂苷Rh2对人白血病MDR细胞K562/VCR生长，凋亡的作用的逆转耐药的情况，探索该药在抗人白血病MDR方面的应用价值。

　　1 材料

　　1.1 药物、试剂与仪器:人参皂苷Rh2为大连生生绿谷生物工程公司生产，质量分数>98%，溶于甲醇，制得20mg/ml，母液备用;柔红霉素(DNR)为意大利法玛西亚制药公司生产;PE标记P-gp鼠抗人单克隆抗体购自美国BD公司;PRMI1640培养基为美国Gibco公司产品;新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;ELx-800型酶标仪为美国Bio-TEK产品;流式细胞仪为美国BD公司产品。

　　1.2 细胞株：K562细胞购自美国ATCC公司，K562/VCR为本实验室自行诱导建株。

　　2 方法

　　2.1 对细胞生长的抑制作用：取对数生长期K562和K562/VCR细胞支撑细胞悬液，调节浓度至5*105/mL，按每孔100μL的体积接种于96孔培养板，培养12h后分别加入一定体积的40、80、120、160、200μg/mL的人参皂苷Rh2溶液100μL(将20mg/mL的母液溶于RPMI1640培养基中制备而成)，各孔板总体积均为200μL，使其质量浓度分别为20、40、60、80、100μg/mL。每一质量浓度均设6孔，同时设有对对照孔和凋零孔。在佳肴48h后采用MTT比色法检测各孔在570nm波长下地习惯度(A)值，计算人参皂苷Rh2对K562和K562/VCR细胞生长的抑制率:抑制率=(1·给药孔平均A值/对照孔平均A值)*100%。根据不同质量浓度下地抑制率绘制量效曲线，由此计算出半数抑制浓度(IC50)

　　2.2 促进细胞凋亡实验：取对数生长期K562/VCR细胞制成细胞悬液，调节细胞浓度至5%105 /mL，按每管0.95mL加至1.5mL离心管中。各管分别加入质量浓度1、2、4、6mg/mL的人参皂苷Rh2溶液50μL(对照组加入PBS50μL),使其终质量浓度分别为50、100、200、300μg/mL，每个质量浓度组设4个副孔。37℃水浴中孵育30min后采用AnnexinV和PI双染法在流式细胞仪上接侧细胞凋亡情况。

　　2.3 对K562和K562/VCR细胞摄取DNR的影响：取对数生长期K562和K562/VCR细胞制成细胞悬液，调节细胞浓度至5*105/mL，按每管0.95mL加至1.5mL离心管中。各管分别加入质量浓度0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL的人参皂苷Rh2溶液50μL(对照组加入PBS50μL)，使其重质量浓度分别为25、50、75、100μg/mL，每个质量浓度组设4个复孔。37℃水浴中孵育30min，洗涤后加入1μg/mL，的DNR溶液1μL，37℃水浴中在孵育30min，然后通过流式细胞术检测P-gp表达的变化情况。

　　2.4 对K562/VCR细胞耐药的逆转实验:取对数生长期K562/VCR细胞之城细胞悬液，调节浓度至5*105/mL，按每孔150μL的体积接种于96孔培养板，培养12h后处理组分别加入质量浓度为0.5、1.0、2.0mg/mL的人参皂苷Rh2溶液50μL(对照组和DNR组分别加入PBS50μL)，各孔总体积均为200μL，使其终质量浓度分别为12.5、25、50μg/mL。人参皂苷Rh2各质量浓度组及DNR组加入0.2mmol/L DNR溶液1μL，使DNR得终质量浓度为0.5μg/mL，对照组不加DNR。每一质量浓度均设6孔，同时设调零孔。在加药48h后采用MTT比色法检测各孔在570nm波长下地A值，计算人参皂苷Rh2对K562/VCR细胞生长的抑制率和耐药性的逆转倍数。

　　逆转倍数=药物处理组抑制率/DNR组抑制率

　　3 结果

　　3.1 K562与K562/VCR细胞生物学特性的比较：K562/VCR细胞株是本实验室采用反复短期暴露法，将K562细胞于不同浓度的长春新碱(VCR)共培养90d左右制备而成。通过对K562细胞与K562/VCR细胞的比较可发现，两者在形态上并无明显差别，但K562/VCR细胞的P-gp表达明显上调(阳性率分别份4.28%、93.80%)，1μg/mL DNR分别与K562和K562/VCR孵育30min后，通过流式细胞术分析显示耐药细胞的DNR的摄取率低于非耐药细胞[平均荧光强度指数(MFI)分别为：280.616]，见图1。

　　1.1 对K562、K562/VCR细胞生长的抑制作用：人参皂苷Rh2处理48h后，K562和K562/VCR细胞的生长受到明显抑制，在低于100μg/mL的质量浓度范围内，抑制率岁药物质量浓度增加呈升高趋势(图2、3)。药物作用48h后，人参皂苷Rh2对K562细胞的IC50为44.5μg/mL，对K562/VCR细胞的IC50为59.4μg/mL。从倒置显微镜下观察细胞形态，人参皂苷Rh2作用后，肿瘤细胞除了增殖受到抑制外，也出现了大量的凋亡细胞，表现为细胞胞浆浓缩，体积缩小，核碎裂呈小块、形成明显的凋亡小题，且凋亡细胞的数量随着作用时间的延长而增加(图3)。

　　1.2 诱导K562/VCR细胞的凋亡：K562/VCR细胞经人参皂苷Rh2在37℃作用30min后，该细胞的死亡明显增加。如表1所示，根据流式细胞术结果，将细胞分为3组，：AnnexinV+组为凋亡细胞

　　(包括早期凋亡和晚期凋亡),AnnexinV+PI+为坏死细胞，AnnexinV-PI-为活细胞。可以发现，随着人参皂苷Rh2质量浓度的增加，凋亡细胞的比例明显增加，活细胞的比例明显下降，但坏死细胞的数量并无明显改变。通过Probit回归分析，该条件下，人参皂苷Rh2杀伤K562/VCR细胞(包括坏死和凋亡)的IC50值为273.5μg/mL。

　　1.1 对K562/VCR细胞耐药的逆转：通过研究不同质量浓度人参皂苷Rh2对K562及K562/VCR细胞摄取DNR的影响发现，K562细胞的DNR摄取率无明显改变(图1-C、D)，但K562/VCR的DNR摄取率明显增加(MFI:280vs941)(图1-G、H)。对人参皂苷Rh2增强K562/VCR对DNR的摄取进行量效关系研究显示，25μg/mL的人参皂苷Rh2借口明显提高。K562/VCR对DNR的摄取，但50μg/mL以上时，随着质量浓度的进一步增加，DNR的摄取率并无明显影响(表2)。

　　本实验还同时观察了人参皂苷Rh逆转K562/VCR细胞对DNR耐药的情况。0.5μg/mL的DNR与K562/VCR共孵育48h后，对其无明显杀伤作用(MTT结果A值1.64±0.17 vs 1.42±0.13，P>0.05)，但在培养体系中加入不同质量浓度的人参皂苷Rh2，K562/VCR对DNR的敏感性明显增强，50μg/mL人参皂苷Rh2可使K562/VCR对DNR的敏感性提高到原来的6.30倍(表3)

　　1 讨论

　　人参是我国传统的名贵中药材人参皂苷是人参抗肿瘤作用的主要有效成分。目前发现，人参皂苷的多种单体，如Rg3，Rh2，Rh3等都具有抗肿瘤作用。人参皂苷Rh2是妊娠中提取的天然活性成分，具有很高的抗肿瘤活性，而对正常稀薄啊无毒性，他具有抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，诱导分化，抑制肿瘤DNA合成，提高荷瘤机体的免疫功能，抑制肿瘤转移和抗肿瘤耐药性增强等多重作用。

　　本研究证明，人参皂苷Rh2对K562及K562/VCR的生长具有明显的抑制作用，且在一定的质量浓度范围内表现较好的量效关系。100μg/mL人参皂苷Rh2作用两种细胞48h后，其抑制率接近90%。但她对两种细胞的抑制能力却并不相同，对K562及K562细胞株对人参皂苷Rh2的耐受能力更强，考虑可能K562/VCR的耐药机制对人参皂苷Rh2也有一定的作用。

　　人参皂苷Rh2具有较强的诱导K562/VCR细胞凋亡的能力，较低质量浓度的人参皂苷Rh2与K562/VCR共同培养48h可明显引起细胞生长的抑制和凋亡，而即使在37℃作用30min，通过流式细胞术也可检测到凋亡细胞，但是IC50明显高于长期培养实验。本研究同时显示，随着人参皂苷Rh2剂量的增加，凋亡细胞的比例(包括早期凋亡和晚期凋亡)明显增加，但坏死细胞的数量并无明显改变，提示人参皂苷Rh2主要通过细胞凋亡途径引起K562/VCR细胞的死亡。Ham等通过对HeLa细胞，MCF10A-ras细胞核MCF7细胞的研究证实人参皂苷Rh2主要通过Ca2+和活性氧(reactive oxygen species)等信号分子上调c-JNK，引起线粒体膜去极化诱发细胞凋亡。Kim等则发现人参皂苷Rh2能激活caspase-1、3和上调Bax，从而诱发神经母细胞瘤细胞株的凋亡。

　　将K562细胞诱导成耐药的K562/VCR细胞后，它对DNR的摄取明显降低，其细胞表面的P-gp的数量显著增加，提示P-gp可能是K562/VCR耐药的中药机制。若将耐药细胞同时与人参皂苷Rh2作用，则细胞对DNR的摄取明显提高，也对DNR的杀伤作用更为敏感，证实人参皂苷Rh2可以逆转K562/VCR的耐药，且低质量浓度的人参皂苷Rh2(12.5-50μg/mL)就能达到明显的效果，而剂量进一步增加后，该效应提高不明显，但人参皂苷Rh2本身可以对K562/VCR细胞产生毒性作用。在DNR摄取率提高的同时，流式细胞术检测K562/VCR细胞表面的P-gp的数量并没有下降。该结果与张晖等发现的人参皂苷Rh2能够逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药，但并不影响其P-gp和MDR-1mRNA表达的结果相似。人参皂苷Rh2在不下调P-gp数量的转台下可以逆转K562/VCR细胞的耐药，考虑可能是：(1)人参皂苷Rh2对P-gp外排泵的功能影响更为明显。(2)抑制了非P-gp的耐药途径，具体机制还有待于进一步研究。

　　本研究提示，人参皂苷Rh2对人白血病细胞K562及其耐药株K562/VCR具有多重多用，不尽能抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞的凋亡，还可以逆转耐药细胞的耐药，是一种具有广阔开发前景的抗白血病药物。

　　参考文献：

　　[1] 　J abrMilane L S , van Vlerken , Yadav S , ettional nanocarrier s to overcome tumor drug resistance [J ] Cancer Treat Rev , 2008 , 34 (7) : 592602.

　　[2 ] 　朱荣鑫, 张赛龙, 金永生 黄酮类化合物抗肿瘤展 [J ] 现代药物与临床 , 2010 , 25 ( 1) : 510

　　[3 ] 　赵　越 , 苏　适 人参皂苷 Rh2 抗肿瘤作用的研生物学杂志, 2003 , 23 (2) : 6163

　　[4 ] 　王占峰, 罗毅男, 洪新雨, 等人参皂苷 Rh2 抗肿瘤作用机制的研究 [J ] 北华大学学报: 自然科学版, 2005

　　[5 ] 　韩　颖, 姜彬慧, 胡筱敏, 等 Fusarium sacchari 转化三七叶皂苷的稀有抗肿瘤成分 [J ] 中草药, 2007 , 38 ( 16) : 832

　　[6 ] 　侯毅鞠 , 袁忠海 , 田　晶, 等 人参皂苷单体 Rh2 诱导髓性白血病细胞株凋亡的时效与量效 [J ] 中国组织工程研究与临床康复, 2008 , 12 ( 12) : 23312334

　　[7 ] 　袁忠海 , 侯毅鞠 , 扈昕虹, 等 人参皂苷单体 Rh2 对人K562 白血病细胞增殖和凋亡的时效和量效分析 [J]床康复, 2006 , 10 (47) : 3941

　　[8 ] 　石淑文, 郭淑芬 多药耐药细胞系 K562/ H H TVCR 的建立及耐药性逆转的研究 [J ]中华儿科杂志, 1998( 1) : 1518

　　[9 ] 　黎　阳, 张铁军, 刘素香, 等 人参化学成分和药理研究进展 [J ] 中草药, 2009 , 40 ( 1) : 164附2