人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca2109细胞周期的影响

　　李　丽, 齐凤英 刘俊茹, 左连富

　　作者单位：(河北医科大学,河北石家庄050017)

　　出处：中国中药杂志第30 卷第20 期

　　[基金项目] 　河北省自然科学基金(301354)

　　[通讯作者] 　3 齐凤英, Tel : (0311) 86265734 , E2mail : xwdw30 @

　　hotmail1com

　　[摘要] 　目的:探讨人参皂苷Rh2 (ginenoside2Rh2 ,GS2Rh2) 对人食管癌细胞Eca2109 生长抑制及细胞周期的影响。方法:应用MTT法测定GS2Rh2 对细胞的生长抑制作用,HE 染色后光镜观察细胞形态变化,应用免疫细胞化学和Western blot 检测细胞周期调控因子cyclinE ,CDK2 (cyclin2dependent kinase 2) ,p21WAF1基因蛋白表达,采用半定量RT2PCR 检测基因mRNA 表达

　　结果:GS2Rh2 对Eca2109 细胞生长有抑制作用,并呈剂量、时间依赖性。20μg·mL - 1GS2Rh2 作用1 d 后细胞达到半数抑制,作用3 d 的Eca2109 细胞较对照细胞数目明显减少,细胞形态向正常细胞方向逆转。细胞周期分析显示,随着GS2Rh2 药物剂量的增加,G0/ G1 期细胞数逐渐增加,S 和G2/M期细胞数逐渐减少,10μg·mL - 1和20μg·mL - 1 GS2Rh2 处理组和对照组比较有显著性差异。20μg·mL - 1 GS2Rh2 处理细胞后,随着作用时间延长,cyclinE 和CDK2 蛋白及其mRNA 表达水平逐渐增高,而p21WAF1蛋白及其mRNA 表达水平逐渐降低。

　　结论:GS2Rh2 可以将人食管癌细胞Eca2109 阻滞于G0/ G1 期,诱导肿瘤细胞分化,并且通过影响细胞周期调控因子cy2clinE ,CDK2 ,p21WAF1基因的表达抑制食管癌细胞的增殖。

　　[关键词] 　人参皂苷Rh2 ;食管癌;细胞周期;cyclinE;CDK2 ;p21WAF1

　　[中图分类号] R 28515 　[文献标识码] A 　[文章编号] 100125302 (2005) 2021617205

　　人参( Panax ginseng) 为五加科草本植物的根,是我国传统的名贵药材,具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学效应。研究证明人参抗肿瘤的活性成分主要是人参皂苷[1 ] ,通过对各种人参皂苷抗肿瘤作用的比较发现,人参皂苷Rh2 (GS2Rh2) 抑制癌细胞增殖作用的能力最强。细胞周期调控的紊乱是肿瘤细胞异常增殖的重要前提,本研究通过体外培养食管癌细胞Eca2109 ,观察GS2Rh2 对其细胞周期及细胞周期调控因子cyclinE ,CDK2 和p21WAF1基因表达的影响,以探讨其抗癌的可能机制。

　　1 　材料和方法

　　1.1料

　　人食管癌细胞株Eca2109 由第四军医大学实验中心提供,本实验室传代培养。GS2Rh2 购自吉林大学基础医学院有机化学教研室。RPMI21640 培养基(Gibco 公司) ,胎牛血清(天津灏洋生物公司) 。cy2clinE ,CDK2 ,p21WAF1 鼠抗人单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司) 。ECL 增强化学发光试剂(SantaCruz 公司) ,聚偏二氟乙烯膜(PVDF ,Milipore 公司) 。Trizol 试剂( Gibco 公司) 。RT2PCR 试剂( Promega 公司) 。

　　1.2胞培养

　　Eca2109 细胞用含10 %胎牛血清的RPMI21640培养基(含100 U·mL - 1青霉素和011 mg·mL - 1链霉素) ,于37 ℃,5 % CO2 恒温培养箱中培养,细胞呈单层生长, 达80 %左右融合时传代, 细胞消化采用0125 % 的胰酶和0102 % EDTA 混合消化液。

　　1.3T 法

　　取对数生长期的Eca2109 细胞,用0125 % 的胰酶和0102 %EDTA 混合消化液消化,用含10 %小牛血清的RPMI21640 培养基配成单个细胞悬液,调整细胞含量为1 ×104·mL - 1后加于96 孔板,每孔体积200μL ,每排6 复孔。加盖,在37 ℃,5 % CO2 恒温培养箱中培养24 h ,更换培养液,第2 排加入011 %溶剂,从第3 排起各排加GS2Rh2 ,终含量依次为40 20 ,10 ,5 ,215μg·mL - 1 ,继续培养,分别于加药后24 ,48 ,72 h 进行MTT 测定:每孔加入5 mg·mL - 1 MTT

　　溶液20μL ,孵育4 h 后,弃去培养液,每孔加入200μL 二甲基亚砜,振荡10 min 后用酶联免检测仪(波长490 nm) 测定各孔吸光度值。

　　1.4细胞形态观察

　　6 孔板中放置盖玻片,培养细胞爬片生长。分别用5 ,10 ,20 ,40μg·mL - 1的GS2Rh2 处理细胞1 ,2 ,3d ,与相应的对照细胞均经95 %乙醇原位固定,HE染色,光镜下观察细胞形态变化。

　　1.5　流式细胞仪检测细胞周期

　　将GS2Rh2 共设立0 ,5 ,10 ,20 ,40μg·mL - 1 5 个药物组和24 ,48 ,72 h 3 个药物作用时间组,用1∶1的胰酶和EDTA 混合消化液消化细胞制成细胞悬液,1 000 r·min - 1离心5 min ,生理盐水清洗,调整每份样品的细胞数为1 ×106·mL - 1 ,70 %冷乙醇固定过夜。采化丙啶(propidium iodide ,PI) 一步插入性DNA 荧光染色方法。每份样品中加入1 mL 染液(PI 50μg·mL - 1 ,RNA 酶10μg·mL - 1及1 % Triton2X 100) ,于4 ℃染色30 min 后上机检测,分析细胞周期。

　　1.6　免疫细胞化学检测基因蛋白表达

　　取对数生长期的细胞,用混合消化液消化,制成单细胞悬液,接种于预先放置了盖玻片的6 孔板中,24 h 后更换培养液,分组加入不同含量的GS2Rh2 ,继续培养24 ,48 ,72 h。取出盖玻片,用0101 mol·L - 1PBS(pH 714) 洗2 次后, 冷丙酮固定10 min。3 %H2O2 去除内源性过氧化物酶,5%羊血清封闭非特异性抗原,加入小鼠抗人cyclinE ,CDK2 和p21WAF1单克隆抗体(应用剂量为1∶50) ,4 ℃过夜;加入二抗,室温30 min ;加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素;DAB 反应显色; 苏木素复染,中性树胶封片,光镜观察阳性信号。

　　Western blot 检测基因蛋白表达

　　接种10 mL (1 ×106·mL - 1) 生长良好的Eca2109细胞于培养瓶中,RPMI21640 培养基培养过夜,次日给予终含量为20μg·mL - 1的GS2Rh2 ,继续培养24 ,48 ,72 h ,弃去培养基,011 mol ·L - 1 PBS (pH 714) 冲洗, 加入200μL RIPA 细胞裂解液(1 % SDS ,1 % Tri2ton X2100 ,5 % 脱氧1.7,100 mg·L - 1苯甲基磺酰氟等) ,细胞刮子收集细胞,冰浴30 min ,12 000 rmin - 1 ,4 ℃离心20 min ,吸取上清液,Lowry 法测定蛋白浓度。12 %十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE) 后转移至PVDF 膜。5 % 脱脂奶粉封闭PVDF 膜2 h ,加入cyclinE ,CDK2 ,p21WAF1一抗(1∶200 稀释) ,4 ℃过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000 稀释) ,37 ℃孵育115 h ,洗膜后加ECL (增强化学发光) 试剂,将PVDF 膜放入X光片暗盒,压片,显影,定影。应用LabWorks 415 分析软件对Western 条带进行定量分析,以β2actin 作为内对照,确定杂交条带的相对吸光度值。

　　1.8　半定量RT2PCR 检测基因mRNA 的表达接种10 mL (1 ×106·mL - 1) 生长良好的Eca2109细胞于培养瓶中,RPMI21640 培养基培养过夜,次日给予终含量为20μg·mL - 1的GS2Rh2 ,继续培养24 ,48 ,72 h ,弃去培养基,冷011 mol·L - 1的TBS 冲洗,以Trizol 试剂提取总RNA ,用紫外分光光度计测定其纯度( A260/ A280 ≥118) 并定量,在1 %琼脂糖凝胶上电泳验证RNA 完整性。在逆转录酶(AMV) 催化下合成cDNA ,以适量cDNA 为模板在Taq DNA 聚合酶催化下进行PCR 扩增。扩增体积25μL ,所用引物均由上海生工生物公司合成(见表1) ,以管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 扩增产量为内参照。扩增条件为:95 ℃ 5 min ,95 ℃ 1 min ,相应温度退火1min ,72 ℃1 min 进行30 个循环,72 ℃延伸10 min。将PCR 产物在2 % 琼脂糖凝胶中电泳,置于凝胶图像分析系统(UVP 公司,美国) 进行吸光度扫描,应用LabWorks 415 分析软件进行定量分析,用目的基因的吸光度值与管家基因GAPDH 吸光度的比值代表

　　目的基因的相对表达含量。

　　119 　统计学处理

　　应用SPSS 1110 统计软件,与对照组比较采用t检验, P < 0105 具有统计学意义。

　　表1 　PCR 扩增所用引物

　　基因　　　　　　　引物序列退火温度/ ℃ 产物长度/ bpcyclinE sense 5’2 ATACAGACCCACAGAGACAG23’ 55 301antisense 52TGCCATCCACAGAAATACTT23’CDK2 sense 5’2 GCTTTCTGCCATTCTCATCG23’ 5218 317antisense 5’2 GTCCCCAGAGTCCGAAAGAT23’Cp21WAF1 sense 5’2 CAGGGGACAGCAGAGGAAGA23’ 58 335antisense 5’2 GGGCGGCCAGGGTATGTAC23’GAPDH sense 5’2 ACGGATTTGGTCGTATTG23’ 52 414antisense 5’2 TGATCTTGAGGCTGTTGTC23’

　　2 　结果

　　2.1　MTT 法测定细胞生长抑制

　　MTT法测定反映活细胞量。结果显示GS2Rh2对Eca2109 细胞生长有抑制作用,并呈剂量、时间依赖性,高剂量组的抑制作用随着时间的积累要大于低剂量组,溶剂对药物作用没有明显影响。提示10 ,20 ,40μg·mL - 1为有效药物剂量,但40μg·mL - 1时已经发生细胞毒作用。按照细胞生长抑制率计算

　　公式:

　　生长抑制率( %) = (1 - 实验组A/ 对照组A) ×100 %

　　GS2Rh2 对细胞生长的半数抑制剂量( IC50 ) 为

　　1913μg·mL - 1 ,故选取20μg·mL - 1 ( IC50的近似值) 分别处理细胞1 ,2 ,3 d ,进行相关检测。

　　2.2GS2Rh2对细胞形态影响

　　经5 ,10μg·mL - 1 GS2Rh2 处理后,与不加药的对照组比较,细胞形态变化不明显。20μg·mL - 1 GS2Rh2 处理3 d 的Eca2109 细胞较对照细胞数目明显减

　　少,细胞成片生长的趋势减弱,互相分散,细胞分裂相明显减少。部分细胞由原来的多角形转变为长梭形,细胞轮廓变得清晰,细胞核变小,核仁数目减少,染色质凝集,胞质浓缩,核质比例降低。而经40μg·mL - 1处理的细胞出现坏死,细胞轮廓消失,核崩解。

　　213 　GS2Rh2 作用后细胞周期变化

　　GS2Rh2 处理24 h 后收集细胞,用流式细胞仪检测各期细胞数。随着药物剂量的增加,Eca2109 细胞在细胞周期中的分布发生了明显的变化。G0/ G1 期细胞数逐渐增加,S 和G2/M期细胞数逐渐减少。但5μg·mL - 1剂量组与对照组无显著性差异,10 ,20μg·mL - 1剂量组与对照组比较差异具有统计学意义

　　( P < 0101 和P < 0105) 。

　　214 　免疫细胞化学检测结果

　　20μg·mL - 1 GS2Rh2 对Eca2109 细胞分别作用24 ,48 ,72 h 后,观察细胞周期调控因子cyclinE ,CDK2和p21WAF1蛋白表达情况,和不加药对照组进行比较。结果显示,cyclinE 和p21WAF1蛋白阳性表达物质主要位于细胞核,胞质轻度着色;CDK2 蛋白阳性物质主要位于细胞质,少数有核着色。随着药物作用时间的延长,蛋白表达变化渐趋明显,尤其在药物作用72 h 后,cyclinE 和CDK2 蛋白表达水平明显降低,而p21WAF1蛋白表达水平有所增高。

　　表2 　GS2Rh2 对Eca2109 细胞周期的影响(.x ±s , n = 3)

　　对照组40170 ±0190 36148 ±0171 22182 ±1142

　　GS2Rh2 5 42127 ±0177 36113 ±0132 21157 ±1102

　　10 45135 ±01821) 35150 ±01412) 19115 ±11151)

　　20 54132 ±11291) 32118 ±01481) 13167 ±11391)

　　注:与对照组比1) P < 0101 ,2) P < 0105

　　215 　Western blot 检测基因蛋白表达(图2)

　　20μg·mL - 1 GS2Rh2 对Eca2109 细胞分别作用24 ,48 ,72 h 后,检测cyclinE ,CDK2 ,p21WAF1蛋白表达情况,与不加药的对照组进行比较。结果显示,药物作用24 h 后蛋白表达发生明显变化, cyclinE 和CDK2 蛋白表达水平降低(cyclinE 变化更为明显) ,p21WAF1蛋白表达水平增高,而且随着药物作用时间

　　的延长,有明显的时效关系。

　　GS2Rh2 处理后cyclinE ,CDK2 ,p21WAF1 mRNA 表达水平增高。药物作用48 h 和24 h 差别不显著,但作用72 h 后,mRNA 表达又进一步发生了变化。

　　3 　讨论

　　GS2Rh2 是由人参中提取的天然活性成分,属于二醇组皂苷。各国学者先后通过多种体内外实验证实,GS2Rh2 可以通过改变细胞周期的时相性分布,诱导细胞分化或凋亡,从而抑制多种肿瘤细胞的增殖与生长[228 ] ,是一种有应用前景的癌细胞分化诱导剂。GS2Rh2 在食管癌细胞中的研究还未见报道,本研究通过体外培养食管癌细胞Eca2109 ,观察了GS2Rh2 对其细胞周期的影响,以及细胞周期调控因子cyclinE、CDK2 和p21WAF1基因表达水平的变化,以探讨其抗癌的可能机制。

　　本研究结果显示,GS2Rh2 能够抑制食管癌细胞Eca2109 的增殖,并且有时间和剂量依赖性。20μg·mL - 1 GS2Rh2 作用1 d 时,细胞的生长抑制率可以达到50 %;作用3 d 后,食管癌细胞生长方式和形态变化开始明显,癌细胞的恶性表型发生逆转。40μg·mL - 1 GS2Rh2 处理后,发生了明显的细胞毒作用,作用3 d 后导致细胞死亡。说明20μg·mL - 1 GS2Rh2对食管癌细胞Eca2109 具有诱导分化作用。

　　GS2Rh2 影响Eca2109 细胞周期时相性分布,随着药物剂量的增加,G0/ G1 期细胞数逐渐增加,S 和G2/M期细胞数逐渐减少。说明GS2Rh2 可以使食管癌细胞阻滞在G0/ G1 期,不再增殖而进行DNA 修复和细胞分化,通过阻止受损细胞进入S 期进行DNA的合成而抑制癌细胞的过度增殖,诱导其分化。G1 期检查点正负向调控基因的功能异常是肿瘤细胞发生异常增殖的机制之一。cyclinE 是细胞G1期到S 期转换过程中基本的和广泛的调节因子[9 ] ,当细胞受到生长信号的刺激时,cyclinE 表达上调,与CDK2 (cyclin dependent2kinase 2) 结合形成活化的cyclinE2CDK2 复合体,导致pRb (视网膜母细胞瘤基因蛋白) 磷酸化,释放出重要的核转录因子E2F ,从而引起一系列与S 期有关的靶分子的表达,促使细胞完成DNA 复制,促进细胞增殖。p21WAF1 是CKIs(cyclin dependent kinase2inhibitors) 中的Cip/ Kip 家族成员之一,在正常细胞中,能与cyclin/ CDK复合物结合并抑制其活性。p21WAF1基因表达降低或失活可以促使细胞发生转化。本研究表明GS2Rh2 将细胞阻滞于G0/ G1 期的同时,还可以影响细胞周期调控因子的表达,使G0/ G1 期正调控基因cyclinE 和CDK2表达减少,负调控基因p21WAF1表达增加,从而抑制食管癌细胞增殖,诱导其分化。GS2Rh2 可以将Eca2109 细胞阻滞于G0/ G1 期,诱导细胞分化,并且影响细胞周期调控因子的表达,这是其抗肿瘤的可能机制之一。

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