肿瘤生物和基因治疗概述

导读：肿瘤生物和基因治疗概述

一、前言
肿瘤的生物治疗主要是通过调动宿主的天然防卫机制或给予机体某些物质来取得抗肿瘤的效应。随着现代生物技术的发展，生物治疗日趋重要，已经逐渐成为治疗肿瘤的第四手段了(1)。它的日益增加的临床应用是基于两方面的发展；其一是对抗肿瘤防卫机制的基础理论的深入理解，其二是生物技术的迅速发展使得临床上大规模运用生物反应调节剂成为可能。肿瘤的基因治疗，目前经FDA批准临床试验的大多数都是通过调动和调节机体免疫功能来实现的，因此也是生物治疗的重要组成部分。生物治疗和基因治疗虽然仍是处于发展的婴儿期，但已有很多典型的病例及其反映出来的理论探索的成功性足以激发人们将这一疗法继续向前推进。面向二十一世纪的肿瘤治疗，抗癌药物的发展将从细胞毒性药物的攻击转向非细胞毒性药物的调节。其中生物治疗和基因治疗将起到极其重要的作用。　
二、生物反应调节剂的概念
生物反应调节剂(BiologicalReoeModifiers,RMs)的概念涉及范围较广。既包括一大类天然产生的生物物质又包括能改变体内宿主和肿瘤平衡状态的方法和手段（2）。虽然作用机制多种多样，但不外乎二大方面。通过干扰细胞生长、转化或转移的直接抗瘤作用或通过激活免疫系统的效应细胞及其所分泌的因子来达到对肿瘤进行杀伤或抑制的目的。　
（一）、定义
Mitchell曾对BRMs有过很具体的定义（3）。一种物质只要具备以下条件之一的就可称为BRMs；1.直接增强宿主抗肿瘤的反应。经免疫刺激来增加效应细胞的数量或活性，或增加可溶性中介物的生产，如淋巴因子或单核因子等。2.通过减少抑制性机制而间接增强了宿主对肿瘤的免疫反应。3.增强宿主对细胞毒物质造成损伤的耐受能力，如通过增加骨髓的白细胞前体来提高化疗病人的耐受力。4.改变肿瘤细胞细胞膜的特点以增强它们的免疫原性，改变转移方式或使瘤细胞对免疫杀伤机制或细胞毒药物更敏感。5.预防或逆转细胞转化，或促进不成熟肿瘤细胞的成熟。Mihich的定义就更加广泛了：一种物质或方法(Aroaches)，能通过调整宿主对肿瘤的反应使二者之间的相互作用朝向有利于治疗肿瘤的方向发展，均可叫BRMs。根据这个定义，除某些药物、细胞因子外，凡是借助于生物学技术的一些新的方法和手段如某些基因治疗等均可列入这个范畴。事实上，这也是当前发展最快、最富有挑战性的一个领域。　
（二）、生物反应调节剂的种类
根据BRMs的定义，从目前的研究资料来看，BRMs有下列种类：
天然或基因重组细胞因子：包括白细胞介素(Interleukin)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)等。
抗肿瘤的各类体细胞和辅助性的造血干细胞：如LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞；骨髓干细胞、外周血和脐带血干细胞等。
抗体：包括各类抗肿瘤单克隆抗体、抗细胞表面标记抗体等。
基因治疗。
肿瘤疫苗。
抗血管生成类。
细胞分化诱导剂。
酶制剂及酶抑制剂。
某些菌类及其有效成份：如卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CP)、链球菌(OK432)、济南假单胞菌等。
植物药包括中药的有效成份：如香菇多糖、云芝多糖、黄芪多糖、刺五加多糖、扶正女贞素LL-E、枸杞多糖、淫羊霍多糖、商陆多糖、人参花总皂苷、冬虫夏草等。
有机酸及小分子合成剂：如左旋咪唑(Levamisole)。
其他。
各类BRMs在抗肿瘤作用中虽然机制有所不同，但不是孤立行动的。它们相互间有一定的关系和影响，形成了BRMs的作用网络。它们与免疫系统、内分泌系统、神经系统等相互影响与协调，共同维持生命机制的稳定与平衡。这就是生命机制的稳态论(Homeostasis)。美国学者Oldham在1984年提出了生物调节(BRM)理论后，十几年来这一领域发展极快。
三、各类生物治疗的概况
生物治疗的领域涉及面极广，几乎生物反应调节剂的所有方面都有不同程度的进展。本文仅就细胞因子；过继性细胞免疫治疗；肿瘤疫苗；单克隆抗体和基因治疗等方面的进展和问题做一代表性的介绍。
（一）、细胞因子
自从基因工程技术在生物医学领域中大规模发展使用后，细胞因子是应用最广泛、疗效最明确的一类BRMs。现以干扰素(IFN)、白介素(Interleukin)、集落刺激因子(CSF)等为例来简要说明它们的临床使用情况。
1、干扰素(IFN)：IFN是一种糖蛋白，首先是由Isaacs和Lindenma在1957年作为一种病毒感染的细胞产物来描述的，它可以防止病毒的进一步感染。IFN的主要作用有：直接抗病毒作用；增强主要组织相溶性抗原(MHC)和肿瘤相关抗原(TAA)的表达；增强自然杀伤细胞(NK)的细胞毒作用；增强抗体依赖性细胞的细胞毒(ADCC)作用；直接的抗细胞增殖作用和抗血管生成作用等。IFN有三种，即IFN-a、IFN-和IFN-g。IFN-a和IFN-具有相同的受体即Ⅰ型受体，IFN-g联接在Ⅱ型受体上。
IFN-a是第一个用于临床的重组基因细胞因子，可皮下或肌肉给药，血浆半衰期为4-6小时，生物活性持续2-3天。于1981年开始临床试用，1986年被FDA正式批准。主要有效病种见表1。
表1、IFN-a的剂量和有效病种
肿瘤方案和剂量有效率%范围(均值)
血液肿瘤　　
毛细胞白血病3MU/天70-90（80）
慢粒白血病5MU/米2/天45-85（58）
淋巴细胞性淋
巴瘤(低度)3-50MU/米2/天或每周三次27-85（48）
多发性骨髓瘤5-12MU/米2/天或每周三次3-18（15）
实体瘤　　
恶性黑色素瘤5-20MU/米2/天或每周三次7-19（18）
肾癌5-20MU/米2/天或每周三次8-23（15）
Kaposi?s肉瘤3-50MU/米2/天或每周三次3-67（30）
内分泌性胰腺
肿瘤3-5MU/米2/天或每周三次33-77（50）
类癌12-24MU/米2/天或每周三次20-40（20）
部分摘自：HaeRM,ordeEC.Oncology6:19-26,1992
　　
2、白介素(Interleukin)：白介素这一名称是特指由白细胞产生的可以调节其他细胞反应的任何可溶性蛋白或糖蛋白物质。在强调这些多肽物质在免疫系统所起的协调作用的这一名称时，它与生长因子(GrowthFactors)这一称呼的区别是人为造成和误导的。因为大多数白介素就是生长因子，反之也一样。做为免疫反应的激素，白介素是通过内分泌(Endocrine)、自分泌(Autocrine)和旁分泌(Paracrine)等的相互作用来实现的。这种白介素链索反应的发生首先是由病原性接触和特异性抗原性反应在局部开始的，由于分泌的白介素有所不同，各类效应细胞表面所分布介素受体种类和数量的不同而引发了各自不同功能的表达。这些细胞包括造血细胞、免疫细胞、内皮细胞和某些非免疫系统的细胞。而白介素的旁分泌作用包括了引发、放大、维持和终结不同阶段的免疫反应等。此外，白介素也通过对血管内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、脂细胞等的作用发挥全身调节作用。目前，以白介素为命名的细胞因子已达15种。其中，以白介素-Ⅱ(IL-2)研究得最为深入，应用最为广泛。
IL-2是一种133氨基酸的糖蛋白，分子量15-kd，含一链内二硫键。通过T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞表面的受体而起作用。由于它能支持T细胞的生长，最初在1976年被定名为T细胞生长因子。IL-2和IFN-g代表了Th1辅助细胞产生的主要的细胞因子。是由抗原和IL-12所诱导的，可被IL-4和IL-10反相调节。IL-2在T细胞的生长成熟中起了关键性的作用。它的多种生物学功能主要包括诱导抗原刺激的T细胞增殖，增强MHC限制性抗原特异性T细胞的细胞毒作用；诱导大颗粒淋巴细胞、NK细胞的MHC非限制性LAK活性；对其他细胞因子的诱导作用。
1985年12月美国国家肿瘤研究所(NCI)的StepheRoseerg在《新英格兰医学杂志》上首次报道了25名晚期黑色素瘤和肾癌病人经大剂量IL-2加LAK细胞治疗后，有效率达44%。这一成绩轰动了世界并开创了IL-2及其所诱导细胞治疗肿瘤的临床应用。经过十几年的临床实践和全世界各大研究所和医院的努力，对于IL-2治疗肿瘤的评价日趋客观和冷静。
美国FDA、加拿大和欧洲的有关医疗卫生权威机构批准用于临床的IL-2商品名为Aldesleukin和Proleukin。FDA批准IL-2用于转移性肾癌的基础资料是从七个机构参加的多中心性研究的255名病人中获得的。所用方案由NCI外科部提供，具体为：IL-26-7.2x105IU/公斤体重/8小时，15分钟内静脉注射，第1至5天，第15至19天。总有效率14%，包括CR4%（4）。有效部位包括肝、肾上腺、肾床、肾原发部位、肺和淋巴结等转移处。总有效率虽然不高，但中位有效时间长达20个月，大部分CR者长期存活。说明了这一疗法可以给一部分晚期病人带来一定好处。
IL-2对黑色素瘤的治疗也处于与肾癌相似的状态。在美国的三个临床Ⅱ期研究表明，用NCI外科部高剂量方案在134名病人中仅获总有效率20%的结果。其中，5名CR占4%，22名PR占16%(5)。由于有效率不高，有效持续时间较短，联合其他BRMs和化疗药物的化学免疫学治疗(Chemo-immunotherapy)或生物化学治疗(Bio-chemotherapy)正在积极开展中。在黑色素瘤所进行的大量临床研究结果表明，有效率稳定在45-60%。是该病种目前有效率最高的治疗手段。
3、造血生长因子(HematopoieticGrowthFactors)：造血生长因子是一类细胞因子的总称。即它们都可以影响造血细胞，在主细胞的生长和分化上起重要的调节作用，在成熟造血细胞的功能激活上也起重要作用。迄今已有25种以上的细胞因子被证明对造血活性有影响。现将常用的几种根据它们作用于不同的造血细胞谱系(Lineages)大致分类如下，见表2。目前美国FDA批准正式临床使用的只有三种，即粒细胞生长因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)和促红细胞生成素(EPO)。　
　
表2、部分造血细胞因子总结
细胞因子克隆年代染色体部位美国使用情况适应症
刺激白细胞生
长的细胞因子　　　　
G-CSF198617q11-22市场销售(1)预防化疗所致骨髓抑制的感染
(2)自体骨髓移植的恢复
(3)治疗严重中性粒细胞减少症
(4)动员外周血祖细胞
GM-CSF19855q23-31市场销售同上
IL-3/GM-CSF融
合分子(PIXY321)1989　临床Ⅲ期中同上
M-CF19855q23临床Ⅲ期中免疫增强（抗真菌）
刺激红细胞生
长的细胞因子
EPO19857q11-22市场销售治疗癌症或爱滋病的贫血
刺激血小板生
长的细胞因子　　　　
TPO19943q26-27临床Ⅰ/Ⅱ期中缓和化疗引起的血小板减少症
IL-319865q23-32临床Ⅲ期中同上
IL-619867q15临床Ⅲ期中同上
IL-11199024临床Ⅱ期中同上
IL-119842q14临床Ⅱ期中同上
影响原始造血细胞活性的细胞因子　　　　
SCF19904q临床Ⅲ期中动员外周血祖细胞
flt3配体1993　临床前尚未确定　
　
（二）、过继性细胞免疫治疗
80年代初期以来，对LAK细胞的特征进行了广泛的研究。这是一群不同于NK或CTL的溶细胞性群体。它们细胞表面标记特征为非MHC限制性杀伤细胞。可以是CD3+或CD3-的非粘附性的并带有NK样标记如CD+16和CD56+的细胞群体。新鲜肿瘤靶细胞上被LAK细胞识别的决定簇性质尚不清楚。这种决定簇广泛表达于新鲜和培养中的肿瘤细胞上和培养的正常细胞上。但新鲜正常细胞上并不具有。LAK细胞是外周血淋巴细胞在病人开始IL-2治疗几天后反跳性增殖时收集的。在体外与IL-2一起培养数天后发展为具高度非特异性细胞毒性细胞后再返输给病人。
迄今，没有令人信服的证据说明加用LAK细胞后，疗效比单独使用IL-2要好。再加上治疗的费用和繁琐性，这一疗法基本已被放弃。只有在移植后淋巴细胞增殖性病(PostTralantatioLymphoproliferativeDiseases,TLD)中最近重新试用了LAK细胞并取得一定疗效，但要注意不能同时输注IL-2，以免刺激淋巴性肿瘤生长。
TILs是直接从肿瘤组织中分离出来的T淋巴细胞，经在离体培养(exvivo)中由IL-2诱导而成。具有肿瘤特异性杀伤活性，特别是对黑色素瘤有效。早期的报告与单独使用IL-2对比具较高的有效率(34%比17%)。但可重复性和缓解时间的长期资料尚缺。此外，需要新鲜的肿瘤组织和长时间的细胞培养，与相应的费用加在一起考虑，使之能在临床研究阶段以外的实际应用成为问题。
第三类IVS(IVitroeitized)细胞的特异性是介于LAK和TILs细胞之间的，需要肿瘤细胞做为抗原来刺激。其中TAK(TumorAntigen-activatedKiller)细胞就是典型代表。外周血淋巴细胞分离出来后，经肿瘤可溶性膜抗原、抗CD3单克隆抗体和IL-2一起培养扩增后返输给病人，达到治病的目的。中国医学科学院肿瘤医院生物治疗协作组用该种疗法曾观察了20名晚期肾癌病人，其中CR1名，PR4名，有效率为25%。截止到96年7月平均生存13个月，一名11公分长下腔静脉瘤栓者生存36个月，仍健在。本疗法所用细胞数量是109级，远远低于Roseerg等所用LAK细胞的1011级，但疗效在同一水平上。说明TAK比LAK有更好的特异性，因此攻击性更强。但仍有一些问题需要解决，如抗原强度和呈递表达的效率，共刺激信号的提供等，因此疗效不稳定。本来免疫原性较强的黑色素瘤效果反而不好。因此，如何使过继性细胞免疫治疗更好地运用于临床实践还需深入研究。目前，其它各类新型的IVS细胞也在努力研制中。　
（三）、肿瘤疫苗
受疫苗在感染性疾病治疗中的影响，肿瘤疫苗在本世纪初开始使用于临床。有所不同的是：前者一般用于预防，而后者往往是治疗的目的。二种疫苗均是使用减毒的全细胞、细胞壁、特异性抗原或非致病性的活微生物来刺激病人的免疫系统。用肿瘤疫苗进行主动免疫治疗的目的是：克服因肿瘤产物造成的免疫抑制状态；刺激特异性免疫来攻击肿瘤细胞；增强肿瘤相关抗原(TAA)的免疫原性。近年来，有关肿瘤疫苗的研究主要集中在解决以下几方面：1.TAA在肿瘤宿主对抗中是靶目标；2.脱落TAA造成的宿主免疫抑制；3.抗原变换和免疫的异质性；4.增加疫苗免疫原性的策略。其中，比较有启发的范例有：纽约KaplaCancerCenter用神经节苷脂类黑色素瘤疫苗后观察到可刺激CD8+T细胞对黑色素瘤相关抗原MAGE-3和MART-1/Melan-A作出相应反应，而且是HLA-A2(ClaⅠHLA)限制性的。15名HLA-A2+黑色素瘤病人术后上述反应阳性者随访12-21个月时仍无复发，而阴性者3-5个月内复发。最近，MSKCC做成了第一个纯化的抗原，目前正在临床使用中。
当前，肿瘤疫苗治疗的研究状况应该说是处于又一重要阶段。虽然过去25年在肿瘤特异性主动免疫治疗上做了大量的努力，但尚无任何一种肿瘤具有疫苗治疗的标准方案。从许多临床Ⅰ、Ⅱ期研究的报告中看到这一疗法确实在一部分病人上获得PR、CR，而且基本无毒性反应。值得注意的是有些病例持续时间相当长可达数年之久。因此肿瘤疫苗的临床使用价值不再是个问题。疫苗的研究也再次成为热点，有些已进入临床Ⅲ期研究。希望在不久的将来，能看到某些肿瘤疫苗的标准治疗方案问世。　
（四）、单克隆抗体
自从Kohler和Milstei1975年首次描述了单抗后，发展了大量的抗人TAA的单抗。它们的作用在肿瘤的鉴别诊断和诊断上已确定其地位，但在肿瘤的治疗上刚刚处于起步阶段。
1.诊断上的用途：
单抗用于诊断目的是发展较快的，产品也趋于多样化。现举例说明如下：（1）.放射免疫造影(RadioImmuneImaging)，1993年FDA批准了铟111放射标记的鼠单抗CyT103(OncocintOV/CR)，这是抗表达在产粘蛋白腺癌细胞上TAG72糖蛋白的。可用于对结肠癌和卵巢肿瘤的体外影象检查。临床研究证明在原发和复发性结肠癌中CyT103具92%的高度敏感性，但特异性略低，为67%。约1/3病人因使用CyT103而改变临床处理方式。虽诊断肝脏病灶不如CT敏感，但对腹腔盆腔内的复发灶更敏感。缺点为尚不能精确定位。（2）.放射免疫导向手术(RadioImmuno-guidedurgery,RIGS)，术前给病人注射抗TAG72的碘125标记的单抗-B72.3，用一种敏感的手提g射线探测仪可以在术中有效地测得放射标记的肿瘤组织从而有效地进行切除。这就叫放射免疫导向手术(RIGS)。临床Ⅱ期研究证明RIGS的敏感性为85%，使30%的病人改变了已定的手术方式。这样就有可能使本来可以治愈的肿瘤得到更彻底的切除和在晚期病人中避免切除不必要的组织器官。目前一个前瞻性的对新一代抗TAG72单抗在原发和复发性结肠癌术中的作用的研究刚刚完成，结果正在总结中。
2.治疗上的用处：
长期以来，发展抗肿瘤的单抗在临床上一直未获成功。FDA曾批准的二种非抗肿瘤单抗为：(1).鼠单抗muromonab-CD3(OrthocloneOKT3)能抗T细胞，作为接受器官移植病人的免疫抑制剂来使用。(2).Abciximad(Reoro)抗血小板上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的嵌合性人/鼠单抗的Fab片段，在冠脉形成术或动脉粥样切除术后的高危组病人中用于抑制凝集。单抗临床使用考虑的主要方面为：通过补体、ADCC或诱导凋亡的直接细胞毒作用；单抗连接到药物、毒素或放射性核苷酸上；抗基因型(特异性)的单抗来诱导特异性免疫反应；抑制生长因子或它们的受体的单抗；离体进行肿瘤净化或激活免疫淋巴细胞等。直至1997年底，FDA批准了Rituxan用于抗肿瘤的临床治疗(7)。Rituxan是一种抗B细胞表面标记CD20的单克隆抗体。对复发性和化疗抗拒性的非霍奇金淋巴瘤有48%的有效率。主要作用机制为诱导ADCC，补体依赖性细胞毒性和凋亡。更令人欣喜的是，1998年9月FDA通过了又一个用于肿瘤治疗的单抗Herceptin。它作用的靶目标是具有HER2基因过度表达的肿瘤细胞。已观察到在三分之一弱的乳腺癌妇女中由于Herceptin的使用而增加了化疗的敏感性，提高了有效率和延长了生存期。Rituxan和Herceptin的成功问世使人们相信单克隆抗体的临床治疗不再是可望不可及的课题。　
（五）、肿瘤基因治疗
肿瘤的基因治疗可以用一句话概括为：将核苷酸转移到靶细胞中以扰乱或纠正某些病理生理过程或其他物质和手段可以通过纠正靶细胞中的基因或基因产物的异常而达同样目的。
基因转导大致可分二大类，体外和体内基因治疗。体外基因治疗是基因在离体(exvivo)情况下被转移或转导到靶细胞中后再放回到动物或人体中。体内基因治疗是基因在体内直接被转导到靶细胞中。要完成这一任务，牵扯到2个相互独立而又有关联的因素。即治疗性的核苷酸或基因及其运载系统。基因的作用机制、大小、表达的稳定性、预期的效果等均是选择的重要因素。第二个因素决定了能否把一个治疗性的基因有效地运载到靶细胞并进行表达。运载系统也叫载体(Vector)，是一个微基因盒(Minigenecaette)。由一段能启动靶基因或转基因转录的核苷酸或叫启动子的成份和一个聚腺苷酸化信号(Polyadenylatioignal)组成。后者能稳定转录了的mRNA。这个微基因盒通常位于一大段核苷酸的主链骨架里。这一骨架的序列可以简单到象在噬菌体里的一样，因此可使载体在体外随细菌而增殖。也可复杂到象大DNA病毒一样。此外，这个微基因盒通常由其他一些大分子所包绕，如蛋白和碳水化合物等。它们在转基因的稳定性、靶向性和表达上执行某些特异性功能。
到目前为止，已鉴定的认为可能有治疗价值的基因数量迅速增加。美国FDA已批准的治疗肿瘤的临床试验项目已有103项。其中以P53在头颈部肿瘤和非小细胞肺癌做的工作最多，已看到有PR、CR和生存期延长的病例。目前这一观察还在继续进行中。然而，能否真正将治疗性基因成功地运用到人体的特定部位中还取决于一个有效的高度选择性的转运系统和高效的基因表达。1999年9月17日宾西法尼亚大学人类基因治疗研究所发生的一例死于基因治疗本身的意外事故正是说明了这个问题。虽然输注了38万亿个腺病毒颗粒企图在肝脏得到足够的鸟氨酸甲酰氨转移酶(OTC)基因的表达以纠正遗传酶缺陷病。但仅有1%转基因达到靶细胞且未看到明显的基因表达。而过量的病毒颗粒分布到全身各器官激发了内在的免疫性和全身炎性反应，导致了病人的死亡。因此，目前在基因治疗的基础科学研究上更多的精力还是强调发展更好的载体。
另一方面，基因治疗的进展也显示出一些可喜的苗头。最近在法国巴黎的第十届国际抗癌会议上Momparler等（8）报告了六例Ⅳ期非小细胞肺癌的病人在验证新药Decitabine的I期临床试验中，有三例活过了16个月。该药的作用机理是重新激活肿瘤抑制性基因来防止正常细胞转化成癌细胞和诱导肿瘤细胞的再分化，使其转回正常细胞。由于结果意外地好，未等I期做完就抢先作了报道。