人参皂苷使癌细胞凋亡的作用

导读：应用流式细胞术检测人参皂苷-Rh2对肝癌Bel-7404细胞凋亡的诱导作用以及对细胞周期的影响。人参皂苷Rh2具有高抗癌性。

近年来的研究发现,我国的名贵中药人参中的人参皂苷具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂苷(ginsenoside,GS)能诱导细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用[1,2]。人参皂甙单体-Rh2(ginsenoside-Rh2,GS-Rh2)是1种原人参三醇型人参皂苷,是红参的主要抗癌成分。本实验以人肝癌Bel-7404细胞株为受试对象,研究GS-Rh2的诱导凋亡作用,旨在进一步阐明中药人参抗肿瘤作用的机理,为将其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。
1　材料与方法
1.1　实验材料与主要仪器
人肝癌Bel-7404细胞株:由中国科学院细胞生物研究所引入,我院临床医学研究所传代培养。人参皂甙-Rh2购自中国科学院生物制品研究所,溶于PBS(pH 7.4)中配成50 mg/ml母液,超滤除菌,-20℃保存;RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品;小牛血清(FBS)为杭州四季青生物工程公司产品;酶联免疫检测仪由第四军医大学与国营华东电子管厂联合研制,型号为DG3022;流式细胞仪型号为Beckerman Coulter EPICS-XL。
1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养　
Bel-7404细胞用含10%小牛血清的培养液(含100 IU/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素),于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,细胞呈单层生长,达80%左右时传代。
1.2.2　药物处理　
细胞传代后,接种于24孔培养板内,当细胞50%~60%融合贴壁良好时,换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测,分别探讨GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及时效关系。
1.2.3　GS-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析　
根据前期实验结果,我们将人参皂苷Rh2共设立5个浓度组,即a、b、c、d、e 5组,浓度分别为0、12.5、25.0、50.0、100.0μg/ml,培养24 h后分别收集各组细胞,然后通过流式细胞仪检测,探讨GS-Rh2诱导凋亡的量效关系并分析细胞周期。
1.2.4　GS-Rh2诱导凋亡的时效关系　
根据我们既往采用MTT法检测人参皂苷-Rh2对Bel-7404细胞的生长抑制作用的结果,其半数抑制浓度(IC 50)为23.7μg/ml,故我们选取25.0μg/ml(IC 50的近似值)GS-Rh2分别作用0、12、24、48 h后,检测凋亡率。
1.2.5　凋亡细胞的检测　
分别收集各组细胞,每组约1×106个,4℃PBS洗2次(pH 7.2),500 r/min,8min,离心去上清,然后加1.5 ml 70%乙醇重悬并固定细胞。经一系列处理后,上机检测,每组计数10 000
个细胞,检测凋亡细胞,其中凋亡细胞所占比例即为凋亡率(AR);并分析处于不同周期的细胞比例。详细方法见参考文献[3,4]。
1.3　统计学处理
不同组间凋亡率比较采用χ2检验,P<0.05为有显著性差异。
2　结果
2.1　人参皂苷-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的量效关系与时效关系
采用流式细胞仪检测凋亡细胞,各处理组凋亡率见表1、表2。
表1　不同浓度GS-Rh2作用下Bel-7404细胞的凋亡率(%)
组别 凋亡率 p
a　　 3.5(3 490/10 000)
b 10.2(1 015/10 000) <0.01*
c 21.5(2 150/10 000) <0.01*
d 27.5(2 753/10 000) <0.01*#
e 27.9(2 791/10 000) <0.01*#
*为与a组比较;#为d、e两组比较,P>0.05
由表1可见,细胞凋亡率(AR)随药物浓度增高而递增,但50.0μg/ml与100.0μg/ml组AR无显著性差异。
表2　GS-Rh2诱导Bel-7404细胞凋亡的时效关系
作用时间(h) 凋亡率(%) P
0 3.7(366/10 000)
12 8.1(813/10 000) <0.05*#
24 21.5(2 150/10 000) <0.05*#
48 39.6(3 957/10 000) <0.01*#
　*为与0 h组比较;#为b、c、d两组比较,P<0.01
　　由表2可见,在25μg/ml GS-Rh2作用下,Bel-7404细胞的AR随作用时间延长而呈现递增的趋势。
2.2　人参皂苷-Rh2作用后细胞周期变化
药物处理24 h后收集细胞,用流式细胞仪检测各期细胞数(每组检测10 000个细胞),结果见表3。
表3　GS-Rh2对Bel-7404细胞周期的影响

各期细胞数
组别
G1 S G2/M
A 6 451 1 980 1569
b 6 597 2 142 901
c 7 282 1 961 757
d 7 320 1 793 887
e 6 874 2 047 1079

由表3可见,不同浓度的GS-Rh2可使G1期细胞明显增多。

3 讨论
中医药理论认为,人参具有健脾补气、宁神益智的功效,而现代药理学研究证实:人参具有抗肿瘤作用。本实验研究了人参中的1种活性成分—人参皂甙-Rh2(GS-Rh2)对人肝癌Bel-7404细胞凋亡的影响,旨在进一步阐明人参抗肿瘤作用的机理,为肝癌的临床治疗提供更多的实验依据。
细胞凋亡是1种由多基因调控的细胞主动死亡过程,在生理性刺激或较弱的外界刺激作用下,细胞内部的遗传程序被启动,核酸内切酶被激活,通过一系列复杂的生化过程后出现非随机性DNA降解。凋亡异常与肿瘤发生、发展有极密切的关系,是近年来肿瘤防治领域的研究热点之一。
目前已从人参中提取出多种具有抗肿瘤作用的皂甙,并且对它们抗肿瘤作用的机制进行了大量研究。韩萍等[5]认为人参皂苷-Rg3有抗肿瘤生长的作用,与其它抗肿瘤药物,如5-氟尿嘧啶、长春新碱、环磷酰胺、氨甲喋呤等合用,有明显的协同作用。Kim等[6]研究表明GS-Rh2有诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡的作用。马文彬等[7]应用流式细胞仪研究GS-Rh2对S180肉瘤细胞周期移行的影响,发现GS-Rh2能引起细胞周期阻滞于S期。为进一步探讨GS-Rh2抑制细胞生长的机理,我们以Bel-7404细胞为研究对象,检测了GS-Rh2作用后细胞凋亡率(AR)以及细胞周期变化。
本实验结果表明,Bel-7404细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示:在一定范围内,GS-Rh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性和时间依赖性。50.0μg/ml组与100.0μg/ml组AR无显著性差异,说明GS-Rh2达一定浓度后,Bel-7404细胞的凋亡率不再随药物浓度的增高而增高。根据Anodrew等[8]的观点,细胞死亡是由正常的细胞周期改变引起的。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关,细胞阻滞于哪一期,凋亡就发生在哪一期。本实验结果还表明,GS-Rh2能阻滞G1期细胞向S期移行,使G1期细胞数量增多。故我们推测,当细胞周期被阻滞于G1期时,在药物作用下,部分肿瘤细胞发生凋亡,未发生凋亡的部分细胞进入S期。当联合使用GS-Rh2与其它主要作用于S期的抗肿瘤药物(如5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤等),则有可能通过“同步化”作用而产生协同效应。
总之,我们的实验已证实人参皂苷-Rh2能诱导凋亡而发挥抗肿瘤作用,但关于其诱导凋亡的详细机制,还有待于进一步研究人参皂苷。