人参单体皂甙Rh2对人喉癌细胞株Hep-2抗增殖作用的研究

导读：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验、流式细胞技术及免疫组织化学S-ABC法分别检测人参单体皂甙Rh2对喉癌细胞株Hep-2的增殖、细胞周期的影响。

　　人参单体皂甙Rh2对人喉癌细胞株Hep-2抗增殖作用的研究

 

　　于广久，康健，郭凤

　　〔作者简介〕于广久(1977-),男,辽宁省丹东市人,在读硕士研究生,主要研究方向是喉癌的肿瘤学治疗。

　　【摘要】目的　探讨人参单体皂甙Rh2对体外培养的人喉癌细胞株Hep-2的抗增殖作用及其作用机制。

　　方法　采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验、流式细胞技术及免疫组织化学S-ABC法分别检测人参单体皂甙Rh2对喉癌细胞株Hep-2的增殖、细胞周期的影响。结果　(1)人参单体皂甙Rh2可明显抑制Hep-2细胞的生长,并呈剂量、时间依赖性作用。(2)人参单体皂甙Rh2 (30μg/ml)处理细胞24h: G1期细胞由60·09%增加至68·86% (P<0·01), S期细胞由18·89%减少至12·30% (P<0·01), G2/M期细胞及凋亡细胞无明显变化(P>0·05),细胞阻滞于G1期。结论　人参单体皂甙Rh2对人喉癌细胞株Hep-2具有明显的生长抑制作用,并可导致其G1期细胞周期阻滞。G1期细胞周期阻滞可能是人参单体皂甙Rh2抗肿瘤作用的机制之一。

　　【关键词】人参单体皂甙Rh2 (G-Rh2);喉癌;细胞周期

　　【中图分类号】　R739·65　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1000-5161 (2003) 06-0034-04

　　Anti-proliferative Effect and the Mechanism of Ginsoniside Rh2on Human Laryngeal Carcinoma Cell Line Hep-2YU Guang-jiu1, KANG Jian1, GUO Feng2

　　(1·Department of ORL-HNS, the First Affiliated Hospital of inzhou Medical College, Jinzhou 121000 China; 2·Department of ORL,the First Hospital of Qiqiha’er City, Qiqiha’er 161005 China)

　　【Abstract】　Objective　To study the anti-proliferative effect and the mechanism of Ginsoniside

　　Rh2 (G-Rh2) on human laryngeal carcinoma cell line Hep-2·Methods　MTT assay was used to

　　evaluate the growth inhibition effect of G-Rh2 on human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 and

　　the flow cytometry for cell cycle analisis·Results　G-Rh2 significantly inhibited the growth of Hep

　　-2 cells with a dose-time-independent manner·After 24 hours treatment with 30μg/ml G-Rh2,

　　the proportion of cells in G1phase increased from 60·09% to 68·86% (P<0·01), while the cells in

　　S phase decreased from 18·89% to 12·30% (P<0·01) and there is no significantly change about

　　cells in G2/M phase and apoptotic cells·Conclusions　G-Rh2 inhibited the growth of human laryn-

　　geal carcinoma cell line Hep-2 significantly, arrested cell cycle in G1phase·It is the anti-tumor

　　mechanism for G-Rh2 possibly by arresting cell cycle·

　　【Key words】　ginsoniside Rh2 (G-Rh2); cell cycle; laryngeal carcinoma

　　人参单体皂甙Rh2 (G-Rh2),为近年来从人参中提取的一种新的有效活性成分。现代医学研究发现: G-Rh2具有较强的抗肿瘤生物活性。研究表明:它对卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、白血病、神经胶质瘤等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。但有关其对喉癌细胞的作用及用以治疗喉癌的研究国内外尚未见报道。为探讨G-Rh2对喉癌细胞的作用,并为G-Rh2治疗喉癌提供实验依据,我们做了相关研究,报告如下。

　　1　材料与方法

　　1·1　细胞株及培养条件

　　喉鳞状上皮癌细胞株Hep-2购自北京市耳鼻咽喉研究所。细胞培养在RPMI1640培养液中,含有10%胎牛血清,青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml。传代用0·25%的胰蛋白酶消化后分瓶,每周传代两次,培养条件: 5%CO2,温度37℃,湿度100%。

　　1·2　药品与试剂

　　G-Rh2由吉林大学医学部天然药物化学研究室提供,制成制剂,浓度20μg/ml纯度≥98%,用时以RPMI1640培养液稀释为不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品,核糖核酸酶(RNase)与碘化丙啶(PI)购自华美生物试剂公司。

　　1·3　MTT试验

　　取传代培养的Hep-2细胞, 0·25%的胰蛋白酶消化后计数,用胎盘蓝拒染法测得活细胞数为90%以上,接种于灭菌96孔培养板中,接种量为5×103cell/孔,培养24h更换培养液。设计五个实验组和一个对照组。实验组的G-Rh2的浓度分别为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml;对照组加入等体积的RPMI1640标准培养液,终体积0·1ml。将96孔培养板在培养箱中培养24、48、72h后,观察细胞形态变化。然后各孔分别加入MTT溶液(5g/l),每孔10μl,继续在培养箱中培养4h后弃去上清,每孔加入DMSO (二甲基亚砜)溶液100μl,震荡后室温静止10min,使其充分溶解,然后用酶标仪于570nm处测定吸光度(A)值,计算细胞生长抑制率。抑制率≥50%为对该药物敏感。生长抑制率(%) = (1-实验组A值/对照组A值)×100%

　　1·4　流式细胞仪检测细胞周期变化

　　用G-Rh2 (30μg/ml)处理对数生长期Hep-2细胞24h,经0·25%胰蛋白酶消化后,收集1×106个细胞, PBS缓冲液洗, 5min×3; 70%冷乙醇4℃固定,于碘化丙啶一步染色液中染色后做

　　流式细胞仪分析。流式细胞仪分析采用Nicolletri法。流式细胞仪为Facscalibur (美国, Becton-Dickinson公司)汞激光激发波长为488nm,15mV,分析软件为Cellquest和Mcdfit LT for ma-chitash V1·01。

　　2　结　　果

　　2·1　G-Rh2对Hep-2细胞形态的影响不同浓度的G-Rh2与Hep-2细胞共同培养24、48、72h后,倒置显微镜下观察:镜下可见对照组细胞贴壁状况良好,细胞呈梭形或多边形生长,细胞透明,折光性好,状态佳。G-Rh2低剂量组(1μg/ml)镜下观察细胞形态无明显变化;中等剂量组(10~30μg/ml)细胞数目略有减少,细胞形态欠规则,呈梭形或少许圆形贴壁生长,胞浆内变化不明显或略有变化,细胞形态变化随着药物浓度增加、作用时间延长愈加明显;高剂量组(40μg/ml)细胞贴壁状况不好,大部分细胞呈圆形贴壁,细胞折光性差,较暗,生长缓慢,细胞内可见黑色颗粒物质,部分细胞已坏死,漂浮于培养液中。

　　2·2　G-Rh2对Hep-2细胞的生长抑制作用

　　实验结果显示: G-Rh2对Hep-2细胞的生长具有明显的抑制作用,实验范围内最大抑制率达84·2%,且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强(除外1μg/ml组别),呈现剂量,时间依赖性作用,经统计学检验差异具有显著性意义(P<0·01),见表1。

　　表1　不同浓度的G-Rh2对人喉癌细胞Hep-2的抑制情况(n=4, x±s, %)

　　组　　别24h　　48h　　72h

　　对照组

　　实验组(μg/ml)

　　1

　　10

　　20

　　30

　　40

　　0±0

　　17·25±2·22*

　　18·00±5·94*

　　28·50±2·08*##

　　36·50±2·89*##

　　48·75±3·10*##

　　0±0

　　20·25±2·20*

　　25·00±4·83*#

　　40·75±10·28*##

　　50·50±4·80*##

　　73·50±6·95*##

　　0±0

　　23·50±3·70*

　　34·50±3·42*

　　51·50±2·89*

　　57·00±6·98*

　　82·75±3·76*

　　*实验组与对照组比较P<0·01。# 24h、48h组别与72h比较P<0·05; ##P<0·01

　　2·3　细胞周期分析

　　经流式细胞仪检测显示: G-Rh2作用于Hep

　　-2细胞24h,细胞阻滞于G1期的积累作用非常明

　　显, G2/M期细胞比例两组间比较,无显著性差异

　　(P>0·05)。凋亡细胞没有明显变化,见表2。

　　表2　G-Rh2处理后, Hep-2细胞周期及凋亡细胞变化情况(n=6, x±s,%)

　　组　别G1期S期G2/M期凋亡细胞

　　对照组60·09±2·48 18·89±0·75 19·8±2·51 1·82±0·53

　　实验组68·86±2·78 12·30±2·12 17·8±1·13 1·81±0·36

　　t5·78 7·17 1·81 0·02

　　P<0·01 <0·01 >0·05 >0·05

　　3　讨　　论

　　许多学者已经证实: G-Rh2在体内，外能够抑制肿瘤或肿瘤细胞细胞生长、增殖。其中，卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、神经胶质瘤等成为其研究的热点。但G-Rh2能否抑制喉癌细胞Hep-2的生长、增殖,国内外尚未见报道。本研究结果提示:G-Rh2可诱导细胞形态学发生改变,影响细胞的增殖活力,抑制其生长,且这一变化在实验范围内呈现剂量、时间依赖性作用。周桂华等[2]观察了G-Rh2对前列腺癌细胞PC-3M的形态学影响。

　　我们的实验结果与其报道相一致。夏丽鹃等[3]在其研究中也证实: G-Rh2能够使黑色素瘤细胞B16形态发生改变,诱导其向上皮细胞形态分化。计算各组别细胞生长抑制率表明: G-Rh2能够明显抑制体外培养的Hep-2细胞的生长,并呈剂量依赖性作用、时间依赖性作用(除外1μg/ml组别),实验范围内最大抑制率可达82·4%,这与李燕的报道结果相近。本实验所测的药物敏感浓度与以往报道的药物敏感浓度相比,相对略低。我们推测:这可能是由于所作用的细胞及实验室条件不同所致。G-Rh2对喉癌裸鼠移植瘤的肿瘤生长是否具生长抑制作用以及是单纯作用还是协同作用有待于深入的研究与探讨。

　　近年来研究发现:许多抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的G0/G1期。杨抚华[4]等对细胞周期调节控制研究认为: G1期之末,是推进细胞周期一个关键时刻,也是药物等因素作用于细胞周期的一个敏感点,细胞周期分裂基因控制着细胞周期的启动及各时期的转换,其中以abc2基因最为重要,该基因是唯一在两个控制点G1-S和G2-M均起作用的abc基因。实验研究也表明: G-Rh2能够影响细胞周期的分布而导致细胞周期阻滞于G1期。学者Lee KY[1]用流式细胞仪检测G-Rh2体外抑制肝癌细胞SK-HEP-1增殖的实验表明: G-Rh2能够使细胞阻滞于G1期,滞留于G1/S关卡处,阻止其向S期发展。Ota T[5]等均报道G-Rh2能够使黑色素瘤细胞B16发生G1期细胞周期阻滞,细胞周期进行受阻。Oh M[6]等在乳腺癌细胞的实验结果也得出与上述相同的结论。但也存在相左的观点。国内学者马文彬[7]报道:用流式细胞仪检测S180肉瘤细胞周期移行影响的实验中发现, G-Rh2可以阻断S180肉瘤细胞由S期向G2期移行,造成S期细胞的堆积,阻滞于S期。我们认为:这种结果上的差异可能与不同肿瘤细胞内在的基因状态不同有关。本实验用流式细胞仪检测显示: G-Rh2作用于Hep-2细胞24h以后,细胞阻滞于G1期的积累作用非常明显,而凋亡细胞没有明显变化。其中G2/M期两组间比较,差异不明显,无统计学意义。提示G-Rh2对G2/M期细胞周期没有影响,与传统的抗肿瘤药物作用于G2/M期的抗肿瘤机制不同。G1期、S期细胞周期比例,对照组于实验组之间均差异有显著性,提示G-Rh2作用24h以后,对Hep-2细胞的周期调控作用主要发生于G1期,抑制细胞DNA合成,滞留于G1/S关卡处,阻止其向S期发展,进而导致S期细胞周期比例下降,使细胞生长、增殖受阻。我们同时也认为:在喉癌细胞Hep-2的细胞分裂周期基因中,不存在两点同时启动的abc2基因,或者说abc2基因在G-Rh2对喉癌细胞Hep-2的细胞周期阻滞中不发挥作用。本实验结果与多数学者的报道相一致,与马文彬的观点相左。对G-Rh2抗肿瘤作用机制的深入研究,将为G-Rh2抗肿瘤作用的机制积累资料,也将有助于G-Rh2在肿瘤治疗领域中的应用。

　　〔参　考　文　献〕

　　[1]　Lee KY, Park JA, Chung E,et al·Ginsenoside-Rh2 blocks the cell cycle of SK-HEP-1 cells at the G1/S boundary byselectively inducing the protein expression of p27kip1〔J〕·Cancer36锦州医学院学报　2003年12月,24(6)

　　Lett , 1996 , 110 (1-2): 193-200·

　　[2]　周桂华,孟艳·人参皂甙单体Rh2对体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M抑制效应的研究〔J〕·白求恩医科大学学报, 2001, 27 (6): 595-597·

　　[3]　夏丽鹃,韩锐·人参皂甙Rh2对体外小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导作用〔J〕·药学学报, 1996, 31 (10): 742-745·

　　[4]　鲁润龙·细胞生存,死亡与癌变〔M〕·合肥:中国科学技术大学出版社, 1996·215-227·

　　[5]　Ota T, Kohno H, Maeda M,et al·Involvement of peanut agglutinin-binding sugar chains in experimental metastasisof B16 melanoma cells〔J〕·Oncol Res , 1993·5 (6-7): 235-43·

　　[6]　Oh M, Choi YH, Choi S,et al·Anti-proliferating effects of ginsenoside Rh2 on MCF-7 human breast cancercells〔J〕·IntJ Oncol, 1999 , 14 (5): 869-875·

　　[7]　马文彬,宋长春·应用流失细胞光度计研究人参单体Rh1和Rh2对小鼠S180肉瘤细胞周期移行的影响〔J〕·白求恩医科大学学报, 1991, 17 (6): 551-553·