人参皂甙Rh2和桦木酸协同诱导A549细胞凋亡的研究

　　李　清1，2，　王晓宇1，　金英花1

　　(1.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林长春　130012;2.大连大学生物工程学院，辽宁大连　116622)

　　摘　要：我们已经发现，天然成分人参皂甙Rh2(G-Rh2)和桦木酸(Bet　A)能够协同作用诱导人源肺癌A549细胞死亡.通过细胞形态观察、流式细胞检测分析、酶活性测定、免疫印记分析等实验技术，从细胞和分子水平提供证据，证明了G-Rh2和Bet　A协同诱导A549细胞死亡的过程为细胞凋亡作用，且涉及线粒体途径.

　　关键词：细胞凋亡;桦木酸;人参皂甙Rh2;协同作用

　　中图分类号：Q291　　　文献标识码：A

　　细胞凋亡通路受阻是导致癌细胞抗药性的主要原因[1]，因此，诱导细胞凋亡是大多数抗肿瘤治疗的主要机制.细胞凋亡通路可能通过不同的途径被启动，如死亡受体途径或线粒体途径，2种途径最终引起效应Caspase(含半胱氨酸的、天冬氨酸特异的蛋白酶家族)的激活.大部分药物诱导的细胞凋亡通过线粒体途径[2].

　　近年来，联合治疗成为抗肿瘤研究的一个重要手段，因为2种药物协同作用有助于放大较弱的死亡信号.所以，联合治疗可能成为一个克服单一治疗阻碍的强有力的策略[3].在以往工作中，我们已通过MTT实验证实了天然成分人参皂甙Rh2(G-Rh2)和桦木酸(Bet　A)能够协同作用诱导人源肺癌A549细胞死亡.本次研究中，我们将通过观察细胞形态学变化，流式细胞仪分析凋亡细胞(sub-G1期细胞)百分比，分析细胞凋亡关键因子Caspase-3激活情况及其底物PARP(多聚(ADP-核糖)聚合酶)断裂情况以及Caspase-9的激活情况等，从细胞和分子水平提供证据，探讨该过程的分子机制.

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂与材料

　　人源肺癌A549细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;G-Rh2购于The　Korean Ginseng　and　Tobacco　Research　Institute;Bet　A和辣根酶标记羊抗兔抗体购于Sigma公司;细胞培养基(DMEM)和小牛血清购于GIBCOBRL公司;Caspase　assay　reagent购于Calbiochem 公司;BCA Protein　Assay　Reagent购于Pierce公司;ECL-enhanced　chemiluminescence　detection　reagents购于Biosciences公司;PARP兔抗抗体购自Santa　cruz公司;兔抗Caspase-9抗体购自Cell　Signaling公司.

　　1.2　细胞培养

　　用含10%(V/V)热灭活小牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM 培养基培养A549细胞，并置于37℃、5%CO2、潮湿的培养箱中孵育.

　　1.3　染色体凝聚与核断裂分析

　　指数生长的A549细胞计数，按5×104细胞/孔铺24孔板;培养24h后，分别加入G-Rh2　7.5μg/mL和/或Bet　A　10μg/mL作用24h;轻轻吸去培养液，每孔加入1mL预冷的75%乙醇固定细胞5min;柔和吸净上清，每孔加入300μL含0.1mg/mL二脒基苯基吲哚的甲醇溶液使细胞核和DNA可见，用荧光显微镜对同一细胞区域分别拍摄可见光和荧光照片.

　　1.4　流式细胞检测分析

　　取指数生长的A549细胞计数，按1.6×106细胞/个铺100mm培养皿;培养24h后，分别加入GRh27.5μg/mL和/或Bet　A　10μg/mL作用24h;4℃条件下，分别将上清及胰酶消化后的贴壁细胞收入同一离心筒;4℃、3　000r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入1mL预冷的PBS，混匀沉淀并将其移入EP管;4℃、3　000r/min离心5min，弃上清，向沉淀中加入1mL预冷的75%乙醇固定细胞，置于4℃保存;用PBS洗2次后，用碘化丙锭溶液(50μg/mL)、1μg/mL　RNase　A及含3.8mmol/L　Triton X-100的柠檬酸钠为细胞染色，置于暗处冰浴30min;用Becton　Dickinson　FACSCalibur细胞计数仪分析上述细胞，通过测定sub-G1DNA含量定量凋亡细胞.

　　1.5　Caspase活性测定

　　蛋白定量后，向96孔黑板中加入50μg全细胞裂解液蛋白质，再加入200μL含25μMcaspase-3底物(Ac-DEVD-AFC)的反应缓冲液，于37℃孵育1h;以100μL含底物的缓冲液加入100μL水作为对照.用SpectraFluoor(TECAN　GENios)仪分别于激发光和发射光波长405和505nm处测定底物断裂产生的荧光水平.

　　1.6　全细胞裂解液的制备

　　取指数生长的A549细胞计数，按1.6×106细胞/个铺100π培养皿;培养24h后，分别加入G-Rh27.5μg/mL和/或Bet　A　10μg/mL作用0、12、18、24h;将细胞及培养液一起收入50mL离心筒，4℃、3　000r/min离心5min，弃上清;向沉淀中加入1mL预冷的PBS，混匀沉淀的细胞并将其移入预冷的EP管，离心升至12　000r/min即停止，弃净上清;向细胞沉淀中加入适量细胞裂解液，充分混匀，冰浴1h;4℃、12　000r/min离心15min，弃沉淀，将上清(即全细胞裂解液)移入新的预冷EP管.

　　1.7　提取物蛋白质浓度的测定

　　取BCA蛋白定量试剂(Pierce公司)并按A∶B=50∶1的比例混匀;依次向96孔板中加入BSA(1mg/mL)0、2、4、8、16、24μL/孔，用于制作标准曲线;再向另外的孔中顺次加入3μL/孔待测样品;向上述孔内加入180μL/孔A∶B混合液，置于37℃保温30min;用酶标仪(ELX800Microplate　reader)于550nm处测定各孔光密度值;制作标准曲线并计算每个样品蛋白质浓度.

　　1.8　聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

　　依据拟分离的蛋白质分子量选择合适的分离胶浓度配制，混匀，灌胶，并加适量水饱和正丁醇覆盖于胶面，过夜;将凝固分离胶的表面正丁醇洗净，控干水分，配制一定量的浓缩胶灌入已插入梳子的分离胶表面;于每个含等量蛋白质的样品中加入占最大样品体积1/4的加样缓冲液，100 ℃沸水浴3～5min;待浓缩胶凝固后，抽出梳子，从左至右依次上样蛋白Marker、样品及加样缓冲液，恒压电泳，样品在浓缩胶时电压为150V，进入分离胶后电压为180V，直至前沿距分离胶面6～7cm.

　　1.9　Western　blot分析

　　将等量的待测样品进行SDS-PAGE电泳;在恒流0.08A的条件下，用湿转仪将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至Immobilon　Transfer　Membranes(Millipore)上，依据分子量的不同分别转移1.5～3.5h;用含5%牛奶(W/V)的PBST封闭该膜1h;用含3%牛奶(W/V)的PBST按一定比例稀释待测蛋白质的特异抗体，并按1∶100的比例加入叠氮钠防腐，与膜于室温孵育3h或过夜.用PBST(含吐温0.1%)洗膜3次，每次10min;用含3%牛奶(W/V)的PBST按一定比例稀释辣根过氧化物酶标记的抗体，与膜于室温孵育40～60min;用PBST(含吐温0.1%)洗膜3次，每次5min;再用PBS洗膜1min.将ECL-增强化学发光检测试剂1、2按1∶1的比例混匀，滴加至膜上，反应1min后曝光胶片.

　　2　结果

　　2.1　DAPI染色及凋亡细胞的形态学观察

　　将对数生长的A549细胞暴露于无毒剂量的G-Rh2(7.5μg/mL)和/或低毒剂量的Bet　A(10μg/mL)24h，用核特异的染料DAPI染色后，观察细胞的形态学变化，见图1A.结果表明，G-Rh2和Bet　A共同作用后，大多数细胞(>75%)可见典型的凋亡细胞形态学特征，如膜起泡、核凝缩和断裂等.但是，G-Rh2单独作用，仅有<10%的细胞表现出凋亡形态;而Bet　A单独作用，具有凋亡形态的细胞也仅为<40%(如图1B、1C).表明G-Rh2和Bet　A对A549细胞的毒性作用为细胞凋亡作用，且二者共同作用实验体系凋亡细胞的百分比远远大于二者单独作用的体系，表明G-Rh2和Bet　A对A549的细胞毒性具有协同作用.

　　2.2　流式细胞检测技术测定细胞凋亡

　　同上述结果相似，FACS测定结果分析表明，在G-Rh2和Bet　A 联合作用的细胞中，处于subG1期的细胞数占总量的26.57%;而在Bet　A 单独处理的细胞中，处于subG1期的细胞数仅占细胞总数的8.20%;G-Rh2单独处理的细胞无明显变化(图2).因为处于subG1期的细胞数代表了凋亡小体的数量，而凋亡小体在细胞凋亡进行的晚期形成，所以在该实验中，测定的凋亡细胞比例低于2.1实验(图1B、1C).但仍然再一次证明了G-Rh2和Bet　A协同作用诱导A549细胞凋亡性细胞死亡.

　　2.3　Caspase-3活性测定

　　Caspase-3是Procaspase-3的活性形式，是执行细胞凋亡的一个关键因子.无论触发死亡受体途径还是线粒体途径，都将导致胞浆中的Caspase-3活性升高.为检测G-Rh2和Bet　A 协同作用诱导A549细胞凋亡涉及的Caspases，我们通过测定荧光标记Ac-DEVD-AFC———一种Caspase-3的荧光标记底物的断裂来评价效应因子Caspase-3的激活.如图3所示，同任一试剂单独作用相比，G-Rh2和Bet　A联合作用导致Caspase-3活性增强，即药物作用12h后Caspase-3的活性表现出上升趋势，随着作用时间的延长，24h时2种药物同时处理的细胞Caspase-3活性的上升最为明显.从而从分子水平证实了该细胞毒性作用属于凋亡性细胞死亡.

　　2.4　PARP断裂情况分析

　　PARP是Caspase-3的下游底物之一.我们用G-Rh2(7.5μg/mL)和/或Bet　A(10μg/mL)作用A549细胞0，12，18，24h，蛋白定量后取等量30μg蛋白质进行免疫印迹分析.如图4所示，药物作用18h后，Bet　A和G-Rh2联合用药组PARP断裂明显，这与Caspase-3活性测定结果一致，又一次从分子水平证明了Bet　A和G-Rh2诱导A549细胞凋亡的协同作用.

　　2.5　Caspase-9激活情况分析

　　Caspase-9是细胞凋亡经线粒体途径的起始因子.为了解G-Rh2和Bet　A联合作用诱导A549细胞凋亡过程中Caspase-9激活情况，我们使用免疫印迹技术检测G-Rh2和/或Bet　A 作用A549细胞0，12，18，24h过程中Caspase-9变化.如图5所示，G-Rh2和Bet　A作用12h后，Caspase-9被切割活化，且二者同时作用时Caspase-9断裂明显增加.表明G-Rh2和Bet　A协同诱导A549细胞凋亡涉及线粒体途径.

　　3　讨论

　　实现协同作用的抗肿瘤药物的选择是建立在这样一个概念的基础上，即通过不同的药物触发肿瘤细胞凋亡可能有助于放大较弱的死亡信号.因此，联合治疗可能证明对于对单一用药有部分反应的恶性肿瘤是有利的，因为它们潜在地减少了肿瘤细胞的抵抗域，所以可能成为绕过抵抗的一个有力的策略.而且，体外实验的高浓度时常在体内难以达到，故低浓度药物的联合作用对于临床治疗更具有可行性[3].

　　取自人参根部的G-Rh2已表明具有抗癌作用[4-5]，以前的研究证明其能够诱导人源肺腺癌细胞A549的凋亡性死亡，而且，Caspase-8/Caspase-3级联被认为是G-Rh2诱导A549细胞死亡过程的执行者[6].Bet　A是从白桦树提取的天然五环三萜类化合物，它主要通过线粒体途径诱导多种肿瘤细胞凋亡[7-9].而且，G-Rh2和Bet　A均不致敏正常的人源细胞表明一定的肿瘤特异性[6，9].因此，我们推测GRh2和Bet　A可能通过功能互补，G-Rh2刺激死亡受体途径和Bet　A触发线粒体途径同时进行，协同作用增加效应因子Caspase的激活，诱导人源癌细胞的凋亡.在以往工作中，我们已通过MTT实验证实了G-Rh2和Bet　A 能够协同作用诱导人源肺癌A549细胞死亡.从本次实验结果可见G-Rh2和Bet　A作用A549细胞的典型凋亡形态，处于subG1期细胞的比例增加，Caspase-3活性上升明显.在免疫印迹分析中，可见药物作用18h后，Bet　A和G-Rh2联合用药组PARP和Caspase-9均断裂明显，且在Bet　A 单独作用12～24h组中，也可见到较清晰的Caspase-9断裂带，表明Bet　A诱导A549细胞凋亡同样经过线粒体途径.但是，我们没有看到Caspase-8的变化(数据未显示).

　　综上所述，我们从细胞和分子水平提供证据，证明了G-Rh2和Bet　A协同诱导A549细胞死亡的过程为细胞凋亡作用，且涉及线粒体途径.该结果可以为进一步的临床研究及应用提供理论依据.

　　参考文献：

　　[1]　CATHERINE　D，STEVEN　FD.Targeting　Apoptotic　Pathways　in　Cancer　Cells[J].Science，2004，305(5689)：1411-1413.

　　[2]　DEBATIN　KM，PONCET　D，KROEMER　G.Chemotherapy：targeting　the　mitochondrial　cell　death　pathway[J].Oncogene，2002，21(57)：8786-8803.

　　[3]　FULDA　S，DEBATIN　KM.Sensitization　for　Anticancer　Drug-Induced　Apoptosis　by　Betulinic　Acid[J].Neoplasia，2005，7(2)：162-170.

　　[4]　TATSUKA　M，MAEDA　M，OTA　T.Anticarcinogenic　effect　and　enhancement　of　metastatic　potential　of　BALB/c　3T3cell　by　ginsenoside  Rh2[J].Jpn　J　Cancer　Res，2001，92(11)：1184-1189.

　　[5]　NAKATA　H，KIKUCHI　Y，TODE　T，et　al.Inhibitory　effects　of　ginsenoside　Rh2on　tumor　growth　in　nude　mice　bearing　human　ovarian  cancer　cells[J].Jpn　J　Cancer　Res，1998，89(7)：733-740.

　　[6]　CHENG　CC，YANG　SM，HUANG　CY，et　al.Molecular　mechanisms　of　ginsenoside　Rh2-mediated　G1growth　arrest　and　apoptosis  in　human　lung　adenocarcinoma　A549cells[J].Cancer　Chemother　Pharmacol，2005，55(6)：531-540.

　　[7]　PISHA　E，CHAI　H，LEE　IS，et　al.Discovery　of　betulinic　acid　as　a　selective　inhibitor　of　human　melanoma　that　functions　by  induction   of　apoptosis[J].Nat　Med，1995，1(10)：1046-1051.

　　[8]　FULDA　S，JEREMIAS　I，PIETSCH　T，et　al.Betulinic　acid：a　new　chemotherapeutic　agent　in　the　treatment　of　neuroectodermal  tumors[J].Klin　Padiatr，1999，211(4)：319-322.

　　[9]　ZUCO　V，SUPINO　R，RIGHETTI　SC，et　al.Selective　cytotoxicity　of　betulinic　acid　on　tumor　cell　lines，but　not　on　normal　cells[J].  Cancer　Lett，2002，175(1)：17-25.