人参皂甙Rh2对人脑恶性胶质瘤SHG-44细胞抗肿瘤作用的蛋白质组学分析

　　人参皂甙Rh2 对人脑恶性胶质瘤SHG-44 细胞抗肿瘤作用的蛋白质组学分析

　　[摘要]目的: 利用蛋白质组学研究技术分离、鉴定人脑恶性胶质瘤SHG-44 细胞经人参皂甙Rh2 ( G-Rh2)作用后差异表达蛋白, 探讨G-Rh2 抗胶质瘤作用机制。方法: 提取32μmol ·L- 1 G-Rh2 处理72 h 后的SHG-44细胞及空白对照组细胞总蛋白; 通过双向凝胶电泳分离蛋白质, 选取2D 图谱中差异表达≥115 倍且P < 0.05 的蛋白质斑点, 使用基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 进行肽指纹图谱( PMF) 鉴定。结果: 与空白对照组比较, SHG-44 细胞经G-Rh2 作用后, 双向电泳发现了20 个差异蛋白质点, 其中16 个蛋白

　　质点表达下调, 4 蛋白质点上调。质谱分析了前5 个差异显著的下调蛋白质点, 分别为丝切蛋白1 (cofilin 1) 、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase , PGK) 、过氧化物氧化还原酶1 (peroxiredoxin 1 , Prx 1) 、热休克蛋白(heat shock proteins , HSP) 和增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen , PCNA) 。结论: 差异表达的蛋白质可能参与了G-Rh2 对人脑恶性胶质瘤的抗肿瘤作用。

　　[关键词] 人参皂甙; 神经胶质瘤; 蛋白质组学

　　脑胶质瘤是神经外科最常见的严重威胁生命的恶性肿瘤, 呈浸润性生长, 手术难以彻底切除, 术后常需要辅以放射治疗和化学治疗, 易复发, 预后差。人参皂甙Rh2 ( Ginsenoside-Rh2 , G-Rh2) ,是由人参中提取的天然活性成分, 属于二醇组皂甙, 具有多靶点、多环节、多效应的抗肿瘤作用,不仅能抑制多种肿瘤细胞的生长并且还具有抗肿瘤细胞转移和提高其他化疗药物疗效的作用, 这可能是通过阻滞细胞增殖周期和诱导凋亡或分化来实现的。G-Rh2 对人脑胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用, 但其机制并不是十分清楚。本研究采用蛋白质组学技术, 分析了人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44 (简称SHG-44) 经G-Rh2 作用后差异表达的蛋白, 以期能够从蛋白质水平为G-Rh2 抗脑胶质瘤的作用机制提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1.1 药物与细胞株　G-Rh2 由吉林大学有机化学教研室惠赠; 人脑恶性胶质瘤SHG-44 细胞购于中国科学院上海细胞研究所。

　　1.1.2 主要试剂与仪器　IPG 干胶条(p H 3～10 ,11 cm) 、载体两性电解质(p H 3～10) 、胶条覆盖液、过硫酸胺、丙烯酰胺、琼脂糖及尿素购自美国Pharmacia 公司, 三氟乙酸、N′-甲叉双丙烯酰胺及CHAPS 购自Sigma 公司, 蛋白质纯化试剂盒( Clean-up Kit ) 购自瑞典Amer sham 公司,DMEM 培养基购自美国GIBCO 公司, 其他试剂为为国产分析纯。CO2 培养箱、IPGp hor 等电聚焦电泳仪、图像扫描仪、恒温循环器及图像分析软件Image Master 2D platinum 购自瑞典Amersham 公司, PROTEAN II Xi Cell 垂直电泳仪购自美国BIO-RAD 公司。Autoflex 型MALDI2TOF 质谱仪。

　　1.1.3 细胞培养和蛋白样品制备　取对数生长期的SHG-44 细胞按1 ×105 ·mL - 1 的细胞密度接种于10 cm2 培养皿中, 待细胞贴壁后实验组加入终浓度为32 μmol ·L - 1 的G-Rh2 ; 对照组加入等量的生理盐水, 培养72 h 后提取细胞总蛋白。0.01mol ·L - 1 PBS 洗涤离心3 次, 在细胞沉淀中加入裂解液( 8 mol ·L - 1 脲素, 4 % CHAPS ,40 mmol ·L - 1 Tris , 60 mmol ·L - 1 DTT) , 漩涡振荡30 min , 冰浴超声1 min 使细胞完全裂解。20 000 ×g、4 ℃离心60 min , 取上清, 根据Clean-up 试剂盒说明书操作纯化蛋白质, 之后用Bradford 考马斯亮蓝G250 法经紫外分光光度计对蛋白质样品定量。

　　1.1.4 双向凝胶电泳　取实验组与对照组蛋白质样品各500 μg , 分别与适量泡胀缓冲液混匀, 总体积为200μL , 加入IPG 干胶条, 置于水平电泳仪电极板上, 按照设定程序行第一向等电聚焦电泳,胶条饱胀与等电聚焦依次进行: 饱胀12 h , 低电压(30 V) ; 500 V , 1 h ; 1 000 V , 1 h ; 5000 V ,1 h ; 8 000V , 2 h 。然后将平衡好的胶条在1215 %SDS 聚丙烯酰胺凝胶中进行第二向电泳。电流为25 mA/ 胶, 当溴酚蓝作为指示剂移至胶底时, 结束电泳, 显色以银染显色。

　　1.1.5 图像采集及统计学处理　脱色后的凝胶在Bio2Rad 凝胶成像系统中用22D Image MasterV510 软件成像及数字化分析。以空白对照组的凝胶图像为参考, 其余各胶与之进行灰度、等电点、相对分子量的校正蛋白点的匹配。统计分析采用t 检验, 选取蛋白质点表达差异大于11 5 倍、P <0105 的斑点作为研究蛋白。

　　1.1.6 质谱图获取及数据分析　对上述样品重新行双向电泳检测, 并行考马斯亮兰染色。结合银染差异性图像分析选取质点行质谱分析。为确保质谱分析的准确性, 对高丰度表达的差异蛋白点在凝胶上定位, 然后切下差异蛋白点胶放入EP 管中, 用测序级胰酶进行胶内消化、洗脱后点样于Autoflex型MALDI2TOF 质谱仪。获得的肽质量指纹图谱用Mascot 软件网络查询, 获取相应蛋白质。

　　2 结果

　　2.1.1 双向电泳分析结果SHG-44 细胞经G-Rh2处理组有(590 ±110) 个蛋白质点, 相应空白对照组有(620 ±90) 个蛋白质点, 匹配率达到80 %。Image Master V510 软件分析后在实验组有20 个差异蛋白质点, 16 个蛋白质点下调和4 个蛋白质点上调。电泳结果见图1 。

　　2.1.2 质谱鉴定分析结果　本实验选取差异明显的前5 个显著下调蛋白质点进行了质谱鉴定分析, 结果为丝切蛋白1 ( cofilin 1 ) 、磷酸甘油酸激酶(p hosp hoglycerate kinase , PGK) 、过氧化物氧化还原酶1 (peroxiredoxin 1 , Prx 1) 、热休克蛋白( heat shock proteins , HSP) 和增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen , PCNA) , 结果见表1 。

　　3 讨论

　　G-Rh2 分子量小, 脂溶性强, 容易通过血脑屏障, 并且具有低毒的特点, 是潜在的较为理想的抗脑胶质瘤化疗药物。本文作者以往研究证实,G-Rh2 可将人脑恶性胶质瘤SHG-44 细胞阻滞在G1 期和诱导凋亡。蛋白质不仅是细胞的组成成分, 也是细胞生物功能的执行者。因此分析G-Rh2作用前后胶质瘤细胞SHG-44 蛋白表达改变, 有助于了解G-Rh2 对SHG-44 细胞增殖周期阻滞和诱导凋亡的作用机制。以下5 种蛋白皆在G-Rh2 作用后显著下调。PCNA 是一种仅在增殖细胞中合成与表达的酸性蛋白(36 000) , 是δDNA 聚合酶的辅助蛋白,为DNA 复制合成的必需因子。细胞内PCNA 含量反映了细胞增殖率及DNA 合成率, 其表达与细胞增殖周期有关, 在G1 期表达逐渐增加, S 期达到高峰, G2 / M 期减少 。据此可以推测PCNA 的表达下调与G-Rh2 阻滞SHG-44 细胞周期有关。cofilin 是一种低分子量(21 000) 的肌动蛋白结合蛋白, cofilin 1 主要存在于非肌肉细胞中, 在细胞质分裂和细胞移动方面起到重要作用。研究表明,在恶性肿瘤中, cofilin1 参与了侵袭伪足的装配和稳定性, 其表达抑制可以降低肿瘤细胞的侵袭性 。cofilin1 在鼠C6 恶性胶质瘤细胞系中高表达 , 并且在人胶质母细胞瘤中, 肿瘤细胞的活动性与细胞内cofilin1 水平有着浓度依赖关系。G-Rh2可能通过减少肿瘤细胞cofilin 1 的表达, 阻碍了胞质分裂, 从而阻滞了SHG-44 细胞增殖周期。研究表明, G-Rh2 也能够遏制鼠C6 恶性胶质瘤细胞在鼠脑内的侵袭性, 这可能与G-Rh2 抑制了cofflin1 表达, 使肿瘤细胞的活动性下降有关。肿瘤细胞的增殖需要染色体扩增和细胞质分离, PCNA 与cofilin 1 表达下调可能是G-Rh2 阻滞SHG-44 细胞增殖周期的作用机制。Prx 1 属于抗氧化蛋白超家族, 对氧化应激介导的细胞凋亡有着抑制作用。研究表明, Prx1 在许多肿瘤细胞中显著高表达, 这可能保护了肿瘤细胞免于程序化死亡而不断增殖。HSP 是细胞受应激原刺激后产生的一组应激蛋白, 除热损伤外,能由多种因素诱导生成, 具有分子伴侣的作用。有研究表明 , HSP 可以抵抗肿瘤细胞凋亡。在人脑胶质瘤细胞中HSP 也明显高表达, 这可能和肿瘤细胞不断增殖, 合成代谢增强, 需要大量的HSP 来调节和稳定这一异常增殖过程, 从而使肿瘤细胞免于凋亡。Prx 1 和HSP 在肿瘤细胞中的高表达, 使肿瘤细胞即使在不利的生存条件下也能逃避多种应激因素诱导的细胞凋亡进而不断增殖。Prx 1 和HSP 表达下调可能是G-Rh2 诱导SHG-44 细胞凋亡增加的作用机制。PGK是糖酵解的关键酶, 也是每种生物得以生存的必须酶, 该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱。G-Rh2 作用后, SHG-44 细胞中PGK降低, 可能导致糖代谢异常, 从而影响细胞的综合代谢, 最终导致细胞死亡。本研究结果表明, 上述差异表达蛋白的研究有助于从蛋白质水平揭示G-Rh2 抗SHG-44 细胞增殖的作用机制。但是G-Rh2 抗脑胶质瘤的作用是涉及多因素、多层面相互关联的复杂过程, 其蛋白质相互作用的内在联系仍不清楚, 需要进一步的研究。