人参皂甙Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

　　人参皂甙Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

　　李殿友1,杨 红2,罗毅男1

　　(1 第一临床学院神经外科 吉林长春130021; 2 基础医学院药理教研室)

　　〔作者简介〕 李殿友(1971-),男,吉林省蛟河市人,助教,医学硕士,主要从事功能立体定白求恩医科大学学报 2000年 第26卷 第4期向神经外科及胶质瘤的综合治疗。

　　〔提 要〕 目的:观察人参皂甙Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,并在分子水平探讨其作用机理。方法:细胞计数法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。结果:①Rh22,4,8μmol/L对C6胶质瘤细胞有增殖抑制作用,且呈明显量效关系;②Rh2作用72 h后,4μmol/L浓度对C6胶质瘤细胞诱导凋亡作用最为明显;③Rh2作用后,G0/G1期细胞百分率明显下降,而S期细胞百分率显著增加。结论:Rh2对C6胶质瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,且这种

　　作用有周期特异性。

　　〔关键词〕 人参皂甙Rh2;胶质瘤;凋亡;细胞周期

　　〔中图分类号〕 Q813.5; R285.5

　　〔文献标识码〕 A

　　人参(Panax ginseng C.A meyer)为五加科多年生草本植物,现代医学表明人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性〔1〕。人参皂甙Rh2(Ginsenoside-Rh2,Rh2)属于二醇组皂甙,是由人参中提取的天然活性成分,近年来体内外实验证实,它可以通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖与生长,并证明其对正常组织毒性甚低〔2〕。目前国内尚未见Rh2对胶质瘤细胞作用的报道。本研究首次观察了Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖影响,并应用流式细胞术探讨其作用机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养 C6胶质瘤细胞株购自美国ATCC公司,由基础医学院病原生物教研室冻存。细胞用含10%灭活小牛血清(长春生物制品所生产)的IMDM培养基(美国GIBCO公司)加入NaHCO32 g/L,青霉素100 U/ml,链霉素100μg/L,置于37℃,5% CO2孵箱中培养,传代时间3~5 d,传代前用0.25%胰酶(日本)消化。

　　1.2 细胞增殖 通过细胞计数检测Rh2(白求恩医科大学天然药物化学研究室分离提纯)的增殖抑制作用。消化培养板中处于对数生长期的C6细胞,制成5×104·ml-1的细胞悬液,接种于24孔培养板中培养,5×104细胞/孔。24 h后分别加入Rh2,

　　终浓度为0,2,4,8μmol/L,于以后5日逐日每组用胰酶消化3复孔细胞,台盼蓝染色判定细胞活性,血细胞计数器计数。

　　1.3 流式细胞术分析 C6细胞接种于24孔培养板,2×104细胞/孔。24 h后分别加入上述终浓度的Rh2,72 h后收集单细胞悬液,70%乙醇固定过夜,RNA酶消化30 min、PBS洗涤2次,各5 min,离心后细胞重悬于碘化丙啶染液,30 min后用激光

　　激发检测荧光,分析细胞周期和凋亡峰。

　　1.4 统计学处理 本实验结果以平均值±标准差(x±s)表示,两两比较采用Student′st检验。

　　2 结 果

　　2.1 Rh2对C6细胞生长的抑制作用 从图1可见,Rh22,4,8μmol/L对C6细胞生长有抑制作用,并呈浓度、时间依赖性。Rh2作用2 d后,8μmol/L组与对照组比较P<0.05;3 d后,Rh2三个剂量组与对照组比较P<0.05,5 d后,P<0.01。其次各用药组之间比较,高浓度组的抑制作用随着时间的积累要大于低浓度组。其差异在统计学上表现为:Rh2作用2 d后,2μmol/L与8μmol/L组间比较P<0.05;4 d后,2μmol/L组与8μmol/L组,及4μmol/L组与8μmol/L组比较P<0.01。以上实验组与对照组细胞存活比率均大于90%,结果提示Rh2可明显抑制C6细胞的生长且没有明显毒性。

　　2.2 Rh2对细胞周期移行的影响 细胞动力学研究表明,用2,4,8μmol/L处理C6细胞72 h后,G0/G1期下降,与溶媒对照组相比差异不显著(P> 0.05); S期与对照组相比显著增加(P<0.01),而G2/M期细胞百分率相对稳定,提示Rh2使C6细胞在S期阻滞(见附表)。

　　2.3 Rh2诱导凋亡作用 图2、图3结果表明,Rh22,4μmol/L有显著的诱导C6细胞凋亡作用,随着浓度增加,凋亡比率明显升高(P<0.001)。

　　Table Cell cycle of C6cells treated with Rh2after

　　72 h (x±s,n=3)

　　Group G0/G1(%) S(%) G2+M(%)

　　Control84.54±1.66 11.60±0.98 3.86±0.08

　　Rh2

　　20μmol/L78.13±7.57 16.83±1.83*3.72±0.07

　　40μmol/L73.18±6.27 22.47±2.00**4.35±0.53

　　80μmol/L61.56±7.03 34.97±3.23**3.47±0.59

　　*P<0.05,**P<0.01vscontrol

　　3 讨 论

　　目前普遍认为恶性肿瘤化学治疗药物引起肿瘤退缩的机理,在于促进肿瘤细胞死亡和阻止其增殖,而细胞死亡既可以通过坏死(necrosis)又可通过凋亡(apoptosis)的形式进行。与坏死不同,凋亡的细胞维持完整的细胞膜结构和功能,细胞解体后形成凋亡小体,不引起周围组织炎症反应〔3〕。细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标,越来越多的研究成果使人们从细胞凋亡角度设计新的抗肿瘤治疗策略、提高化疗效果〔4〕。据报道,Rh2可通过诱导Caspase 3激活通路使人肝癌细胞SK-HEP-1出现凋亡,并伴有细胞周期动力学的特征性变化〔5,6〕。在检测Rh2对C6胶质瘤细胞增殖率的实验中,不同浓度(2,4,8μmol/L)的Rh2对C6细胞的增殖抑制作用随剂量增加和时间延长而明显增强;台盼蓝排斥实验证实,C6细胞存活百分率不论实验组还是对照组均大于90%,实验结果说明Rh2可明显抑制体外C6胶质瘤细胞的增殖,且在实验剂量范围内没有明显毒性。

　　肿瘤化疗中,G0/G1期细胞的大量存在是肿瘤复发和转移的主要原因之一,而S期为DNA合成期,大量该期细胞DNA解旋复制,沿DNA单链暴露出更多活性部位,可为化疗药物提供更多的作用位点,有助于提高化疗的疗效。本实验研究发现,实G0/G1期细胞百分率显著下降,S期明显升高,而G2+M2期相对稳定,这说明Rh2能有效地动员C6细胞由G0/G1期进入S期,同时,它又能阻止S期细胞进入G2/M期,导致细胞在S期阻滞,从而抑制细胞增殖并且提高化疗效果。Rh2是由人参中提取的天然活性成分,其毒性低,分子量小且为脂溶性,易通过血脑屏障,是一种潜在的化疗药,故可与其它周期特异性药物联合应用,提高脑胶质瘤化疗效果。

　　现已明确大多数化疗药物可以通过诱导细胞凋亡的形式杀灭肿瘤细胞,达到治疗目的。细胞凋亡可能是不同化疗药物殊途同归的作用结果,成为评价化疗疗效的一项新指标。本实验通过流式细胞仪检测到由于核小体间DNA裂解形成的凋亡峰,表明Rh2在一定浓度范围内可以通过诱导细胞凋亡而非细胞毒作用,抑制肿瘤细胞的生长。总之,Rh2对C6胶质瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,这种作用具有周期特异性,但其具体作用机理有待于进一步研究。

　　〔致谢:本实验药品为我校天然化学药物研究室陈燕萍教授惠赠,实验过程中得到病原生物教研室李凡教授大力指导,特此致谢。〕

　　〔参考文献〕

　　〔1〕张均田.人参研究的回顾和展望〔J〕.药学学报,1995,30:321.

　　〔2〕徐景达.人参皂甙-Rh2的研究进展〔J〕.长白山中医药研究与开发,1996,5(5):48.

　　〔3〕Darzynkiewicz Z, Li X, Gong JP. Assays of cell viability:discrimination of cells dying by aopoptosis〔J〕.Methods CellBiol,1994,41:15~38.

　　〔4〕Micheau O,Solary E,Hammann A,et al.Sensitization of cancercells treated with cytotoxic drugs to fas-mediated cytotoxicity〔J〕.J Natl Cancer Inst,1997,89(11):783~789.

　　〔5〕Lee KY,Park JA,Chung E,et al.Ginsenoside-Rh2blocks the cellcycle of SK-HEP-1 cells at the G1/S boundary by selectively inducing the protein expression of p27kipl〔J〕.Cancer Lett,1996,110(1~2):193~200.

　　〔6〕Park JA, Kim KW, Kim SI. Caspase specifically cleaves p21WAF1/CIP1 in the earlier stage of apoptosis in SK-HEP-1human hepatoma cells〔J〕.Eur J biochem,1998,257(1):242~248.Inhibition of growth and induction of apoptosis of GinsinosideRh2on cultured C6glioma cellsLi Dianyou1,Yang Hong2,Luo Yinan1

　　(Department of Neurosurgery,The First Clinical College,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130021)〔Abstract〕 Objective:To investigate Ginsinoside (G-Rh2′s) function of suppressing growth,inducing apoptosis of glima C6cells and to find the mechanism of this effect at molecular level.Methods:Cell proliferation was evaluated by cell numeration.And cell proliferation cycle and apoptosis were tested by flow cytometry (FCM).Results:①G-Rh2exerted a dose-dependently inhibitory effect on cell proliferation at the dose between 2~8μmol/L.②After treated with G-Rh2of 4μmol/L for 72 h,the most significant

　　apoptosis effect on C6cells was induced.③Exposure to G-Rh2resulted in obvious increase in S phase and

　　decrease in G0/G1phase of C6cells.Conclusion:G-Rh2can inhihit proliferation and induce apoptosis of C6 cells and this effect is cycle-specific.〔Key words〕 G-Rh2;glioma;apoptosis;cell cycle