人参单体皂甙Rh2对非小细胞肺癌患者肺泡巨噬细胞免疫活性的影响

　　人参单体皂甙Rh2对非小细胞肺癌患者

　　肺泡巨噬细胞免疫活性的影响

　　【摘要】目的: 探讨人参单体皂甙Rh2( G-Rh2)对非小细胞肺癌患者肺泡巨噬细胞( AM) 分泌细胞毒效应分子的影响。方法: 采用ELISA法和酶法分别检测35例非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液及其AM培养上清液中肿瘤坏死因子( TNF-α)和NO浓度, 并分别用干扰素-α( IFN-α)、G-Rh2以及两药联合干预AM培养, 检测其上清液中TNF-α和NO变化情况。结果: 所有非小细胞肺癌患者其AM均可产生一定量的TNF-α和NO; 非小细胞肺癌患者荷瘤侧肺NO和TNF-α活性在肺泡灌洗液及AM培养上清液中均明显低于非荷瘤侧肺。G-Rh2干预下AM培养上清液中TNF-α和NO的浓度较对照组明显升高( P< 0.05); 与TNF-α干预AM培养上清液中TNF-α和NO的浓度比较差异无统计学意义( P>0.05)。G-Rh2和TNF-α联合干预时AM培养上清液中TNF-α和NO的浓度明显大于TNF-α或G-Rh2单独干预(P< 0.01)。结论: G-Rh2能促进非小细胞肺癌患者肺泡巨噬细胞分泌细胞毒效应分子, 联合干扰素时其作用更显著, 两者具有协同性。

　　【关键词】人参单体皂甙Rh2; 非小细胞肺癌; 肺泡巨噬细胞; 免疫活性

　　人参单体皂甙Rh2( ginsenoside Rh2, G-Rh2)系近年来从人参中提取的一种新的有效活性成分,具有广泛的药理作用。现代医学研究发现G-Rh2具有较强的抗肿瘤生物活性, 对卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、白血病以及人肺腺癌等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。近年来, 随着中药抗肿瘤研究热潮的掀起, 中药对机体免疫细胞功能的影响也越来越受到广泛的关注。笔者前期的研究发现: 肺癌患者巨噬细胞( alveolar macrophage, AM)抗肿瘤免疫功能低下, 提示提高肺癌患者巨噬细胞免疫活性可成为肺癌综合治疗方法之一。因此, 笔者拟通过支气管肺泡灌洗术收集非小细胞肺癌患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF), 分离纯化出肺泡巨噬细胞, 进行体外培养干预, 旨在探讨G-Rh2对其免疫功能调节作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　35例病例选自2003年10月至2004年1月间我院( 中南大学湘雅医院) 行纤维支气管镜(纤支镜)检查的门诊或住院病人,患者均未接受化疗、放疗或免疫治疗。经纤维支气管镜检查并活检组织病理证实为非小细胞肺癌,其中男25例, 女10例, 年龄40~ 66( 平均52)岁; 腺癌18例, 鳞癌17例; 右肺19例, 左肺16例; 中央型22例, 周围型13例。分型按WHO( 1981年) 标准; 分期按1997年UICC标准;Ⅰ期8例,Ⅱ期16例,Ⅲ期7例,Ⅳ期4例。分期检查包括胸部正、侧位X线片, 纤维支气管镜检查, 胸部、腹部、头颅CT, 骨扫描( SPECT)。

　　1.2 主要试剂

　　一氧化氮试剂盒和人肿瘤坏死因子-α( TNF-α) ELISA试剂盒均购于晶美生物(北京)有限公司; G-Rh2 由吉林大学基础医学院生化研究室提供; IFN-α购于沈阳三生制药有限公司。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 BALF收集

　　患者于术前12h禁食, 术前0. 5h肌注阿托品0. 5mg, 雾化吸入2%利多卡因10mL, 纤支镜经鼻腔进入后予2%利多卡因5mL行常规局麻, 根据胸片或CT及纤支镜检查确定肺癌患者荷瘤侧肺。灌洗肺段均选择荷瘤侧肺右中叶或左舌段, 如果该部位因肿瘤阻塞, 明显出血等原因不能灌洗, 则选择非荷瘤侧肺。将纤支镜直接嵌入选定部位注入2%利多卡因2mL后,注入37℃注射用生理盐水100mL, 并立即回抽液体至硅化的塑料容器内, 回抽压力控制在50~100mmHg( 1mmHg= 0. 133kPa) , 回收的BALF放入4℃ 保温桶并立即送实验室处理。BALF的收集均在活检之前进行。

　　1.3.2 AM分离纯化

　　用两层无菌纱布过滤回收BALF后, 记录回收量, 取少量行细胞分类计数。以上严格按照“ 支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范( 草案)”操作。将回收液1200 r/min离心10min, 收集离心后肺泡灌洗液于-70℃贮存待测。沉渣用DHank’s平衡液漂洗1次,RPMI 1640液( 含L-谷氨酰胺1mmol/L, 青霉素100kU/L, 链霉素100mg/L, 10%小牛血清)调整AM浓度为5*108个/L, 采用台盼蓝染色检测AM活率。取上述细胞悬液加入细胞培养板中, 每孔2mL, 共4孔, 5%CO2, 37℃ 饱和湿度培养箱中贴壁培养1h, 以不含小牛血清的RPMI 1640液轻漂洗2次, 除去未黏附细胞, 即得纯净的AM( 在85%以上) 。

　　1.3.3 AM干预培养

　　在上述纯化后的AM中分别加入下述药物进行干预：(1)对照组，予以2mL不含G-Rh2或IFN-α的RPMI 1640液培养干预; ( 2) G-Rh2组, 予以2mL含50[1]mol/LG-Rh2的RPMI1640液培养干预; (3) IFN-α组, 予以2mL含IFN-α250 kU/L的RPMI 1640液培养干预;( 4) G-Rh2+ IFN-α组, 予以2mL含上述相同浓度G-Rh2, IFN-α的RPMI 1640液培养干预。在5%CO2, 37℃ 下培养24h, 收集培养上清, 1200r/min离心10min, 收集上清于-70∃ 贮存待测。

　　1.3.4 TNF-α和NO的浓度测定

　　采用双抗体夹心ELISA法和酶法分别测定TNF-α和NO的浓度, 严格按照试剂说明步骤进行。酶标仪波长分别设定为530nm和450nm.

　　1.4 统计学处理

　　用SPSS11. 0统计软件包对数据进行统计学分析, 所有测得值均采用均数)标准差( x±s) 表示, 多组间比较采用多因素方差分析。P<0. 05为差异有统计学意义。

　　2. 结果

　　2.1 支气管肺泡灌洗液及肺泡巨噬细胞的收集与检测

　　荷瘤侧肺与非荷瘤侧肺比较, 腺癌组与鳞癌组比较, 其回收率、有核细胞总数、AM百分率及AM活率均无统计学差异(P> 0. 05) (表1)。

　　2. 2 非小细胞肺癌患者BALF及AM培养上清液中TNF-α的活性

　　非小细胞肺癌患者荷瘤侧肺BALF及AM培养上清液对照组中TNF-α水平低于非荷瘤侧肺(P<0. 05)。腺癌组与鳞癌组BALF及AM培养上清液对照组中TNF-α水平无统计学差异( P> 0. 05) 。经IFN-α或G-Rh2刺激后各组TNF-α活性均增强, 与对照组中TNF-α活性相比较差异有统计学意义( P< 0. 05) , 非荷瘤侧肺较荷瘤侧肺增强更为明显, 腺癌组与鳞癌组差异无统计学意义( P> 0. 05)。但经IFN-α和G-Rh2单独刺激后, IFN组与G-Rh2组TNF活性比较差异无统计学意义( P> 0. 05) 。经IFN-α和G-Rh2共同刺激后各组TNF-α活性均显著增强, 与经IFN-α或G-Rh2单独刺激后各组TNF活性比较差异有统计学意义( P< 0. 01), 而非荷瘤侧肺较荷瘤侧肺增强更为明显, 腺癌组与鳞癌组比较无统计学差异(P>0. 05) (表2)。

　　2. 3 非小细胞肺癌患者BALF及AM培养上清液中NO水平

　　非小细胞肺癌患者荷瘤侧肺BALF与AM培养上清液中NO水平低于非荷瘤侧肺(P<0. 05)。腺癌组与鳞癌组BALF与AM培养上清液中NO水平差异无统计学意义( P> 0. 05)。经IFN-α或G-Rh2刺激后各组NO活性均增强, 明显高于对照组( P< 0. 05), 非荷瘤侧肺较荷瘤侧肺增强更为明显, 腺癌组与鳞癌组比较无统计学差异( P> 0. 05)。但经IFN-α和G-Rh2单独刺激后, IFN-α组与G-Rh2组NO活性比较差异无统计学意义( P>0. 05)。经IFN-α和G-Rh2共同刺激后各组NO活性均显著增强, 明显强于经IFN-α或G-Rh2单独刺激后各组NO活性( P< 0. 01) , 而非荷瘤侧肺较荷瘤侧肺增强更为明显, 腺癌组与鳞癌组比较差异无统计学意义( P> 0. 05) (表3)。

　　3. 讨论

　　巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成分,具有吞噬、杀伤、递呈抗原、分泌生物活性物质、调控局部组织微环境以及抑制肿瘤等多种功能, 构成了机体非特异防御的基础。巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的重要方式是分泌NO, TNF-α, 过氧化氢及超氧阴离子等多种细胞毒效应分子, 因此, 肺泡巨噬细胞NO, TNF-α活性高低在一定程度上反映肺癌患者免疫功能的强弱。本实验结果表明: 无论是肺癌非荷瘤侧肺还是荷瘤侧肺, 均能产生一定量的NO和TNF-α, 其机制可能是肺脏与外界直接相通, 肺泡巨噬细胞长期不断地与吸入性抗原或非特异性刺激物接触, 肺泡巨噬细胞被激活而产生NO和TNF-α。非小细胞肺癌患者荷瘤侧肺NO, TNF-α活性在肺泡灌洗液及AM培养上清液中均明显低于非荷瘤侧肺, 提示肺癌患者免疫功能尤其是肿瘤局部肺泡巨噬细胞免疫功能存在缺陷, 这可能与荷瘤侧肺肺泡巨噬细胞长期处于低氧环境有关, 因此努力提高肺癌患者巨噬细胞免疫活性可成为肺癌综合治疗方法之一。

　　巨噬细胞在多种细胞因子如粒-巨噬细胞集落因子( GM-CSF)、干扰素( IFN) 、白细胞介素1, 2( IL-1, 2) 以及脂多糖( BCG)、卡介苗结核分枝杆菌(MTB)、佛波酯( phorbol esters) 等单独或联合刺激下产生TNF-α和NO。本实验结果显示非小细胞肺癌患者巨噬细胞无论是来自非荷瘤侧肺而是荷瘤侧肺、腺癌还是鳞癌, 在干扰素IFN-α或G-Rh2刺激下均可引起细胞毒效应分子NO和TNF-α分泌增多, 表明与干扰素一样, G-Rh2也具有增强肺癌患者肺泡巨噬细胞免疫功能的作用。其机制可能是IFN与G-Rh2作为第一启动信号在第二信号( 如脂多糖) 的协同下, 诱导MHC-Ⅱ类抗原及Fc受体表达, 调节TNF-α, NO和IL-1等活性物质的生成。反过来TNF-α又可作用于巨噬细胞, 使其增加NO的分泌。本实验结果还显示两者联合后, 巨噬细胞分泌NO和TNF-α进一步增多,提示两者在提高巨噬细胞免疫功能方面具有协同性。

　　笔者前期的研究已表明G-Rh2具有抗肿瘤细胞增殖活性, 本研究又发现G-Rh2具有促进肺癌患者肺泡巨噬细胞分泌细胞毒效应分子作用, 因此我们认为G-Rh2是一种既具有抗肿瘤增殖又能提高机体免疫细胞功能双重作用的药物。