人参皂苷Rh2 对人膀胱癌细胞T24 增殖和凋亡的影响

　　摘要:目的: 探讨20(S) -人参皂苷-Rh2( GS-Rh2) 对人膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法: 采用MTT 法检测GS-Rh2 对T24 细胞增殖抑制率; 光学显微镜观察GS-Rh2 作用前后细胞形态变化; 流式细胞仪检测GS-Rh2 对T24 细胞凋亡和细胞周期分布影响; RT-PCR 检测mRNA 表达。结果: GS-Rh2 在5 mg /L ～ 21.97mg /L 浓度范围内，对T24 细胞增殖无明显抑制作用; 21.97 mg /L ～ 160mg /L 浓度范围内，GS-Rh2 对人膀胱癌T24 细胞的生长有抑制作用，呈量-效关系，IC50为37mg /L。T24 细胞经GS-Rh2( 40mg /L) 作用后光镜下呈死亡形态改变; 细胞增殖指数( PI) 由42.534% 下降至31.03%; 早期凋亡细胞数明显增加;p53 和myc mRNA 表达下降。结论: GS-Rh2 能显著抑制人膀胱癌T24 细胞增殖、诱导T24 细胞凋亡，其机制可能与GS-Rh2 下调P53和myc mRNA 表达，阻滞细胞进入S /G2 期等有关。

　　关键词:人参皂苷-Rh2; T24 细胞; 增殖; 凋亡

　　膀胱癌是以血尿为主要症状的癌症，是中国最常见的泌尿系统肿瘤，其主要病因是基因及环境因素的影响，目前膀胱癌的基本治疗手段为外科手术、放疗和化疗，但对晚期癌症的治疗效果不太显著。人参皂苷是人参的主要活性成分，目前研究发现，人参皂苷-Rh2 ( GS-Rh2) 的抗癌作用最强。国内外文献先后报道GS-Rh2 对人卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌细胞、前列腺癌等肿瘤细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用，但关于其对膀胱癌细胞作用的研究较少。本实验就GS-Rh2 对人膀胱癌T24 细胞的作用及其可能机制进行探讨，旨在为膀胱癌的临床治疗提供更多的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验药物20 ( S) -人参皂苷-Rh2 ( Ginsenoside-Rh2，GSRh2)，购自广东省药品检验所，规格: 20mg /瓶，批号: 111748-200501。

　　1.2 细胞人膀胱移行细胞癌细胞T24( 中国科学院上海生科院细胞资源中心) 。

　　1.3 试剂胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) ;MTT( 美国AMRESCO 公司，批号Amresco0793) ; Annexin V-FITCkit( BioVision 公司，批号K101-100) ; 碘化丙啶( PI) ( BioVision公司) ; RPMI-1640 ( 杭州吉诺生物医药技术有限公司，批号GNM31800) ; 胰酶( Gibco 公司，批号25200-072) ; PBS 粉剂( 武汉博士德生物工程有限公司，批号AR1155) ; TRIZOL( Invitrogen公司，批号15596-026 ) ; PrimeScriptTM RT reagent kit 和SYBR Premix Ex TaqTM 试剂( 购自大连Takara 公司) 。

　　1.4 仪器荧光定量PCR 仪( ABI，7500) ; 高速冷冻离心机( 美国BECKMAN 公司) ; CO2

　　培养箱( 美国Thermo 公司) ; 倒置显微镜( 日本NIKON 公司) ; 超净工作台( 新加坡ESCO 公司) 。

　　1.5 方法T24 细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基( 含100U/ml 青霉素和100U/ml 链霉素) ，于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，细胞消化采用0.25% 含EDTA 胰酶。GS-Rh2 用70%乙醇水溶液配制。取对数生长期T24 细胞，以1.5 × 105 /孔浓度接种于24 孔板，每孔体积500μl。培养24h后，换液并加入终浓度分别为5、10、20、40、80、160mg /L 的GSRh2，并设置空白对照组和乙醇溶剂对照组，每组设3 个复孔。培养24h 后，弃培养液，每孔加入50μl 5mg /ml MTT 和450μl 不含血清RPMI-1640 培养液。继续培养4h 后弃去培养液，每孔加入500μl DMSO，避光震荡孵育10min，用酶联免疫检测仪( 波长570nm) 测定每孔吸光度值( A) 并计算细胞生长抑制率( IR) 和半数抑制浓度( IC50) 。IR = ( 1 - 实验组A 平均值/对照组A 平均值) × 100%; IC50 由作图法得出。经多次重复实验发现5、10、20mg /L 浓度的GS-Rh2 对细胞均无明显抑制作用，但当浓度达到40 mg /L 时GS-Rh2 对细胞的抑制率突然显著上升且超过50%， 40、80、160mg /L 浓度的GS-Rh2 抑制率分别为61.58%、97.02%、98.96%，表明GS-Rh2 对T24 细胞增殖抑制的敏感浓度在20 ～ 40 mg /L 之间。以1.5 × 105 /孔浓度接种T24 细胞于24 孔板，设置空白对照组、溶剂对照组、药物各浓度组，药物浓度以10mg /L 为起始浓度，30% 递增，共设置7 个浓度，最大浓度48.3mg /L。每组设3 个复孔，检测方法同上。

　　1.5.1 细胞形态学观察取对数生长期细胞种25cm2 的培养瓶，当细胞长满培养瓶底约60%时置于光学显微镜下观察细胞形态后加药。设空白对照组、溶剂对照组和GS-Rh2 的IC50

　　浓度组，培养24h 后，于显微镜下观察细胞形态变化并作记录。

　　1.5.2 细胞周期检测收集药物作用24h 的细胞，用PBS 洗涤1 次，加入1ml 预冷的70% 乙醇，4℃固定过夜。取出细胞后，1200rpm 离心5min，弃去固定液后用PBS 洗细胞1 次，加入500μl PI 染色，避光孵育15min 后上机检测，分析细胞周期。测出各期细胞所占比例并比较增殖指数( PI) 。PI = ( S 期+ G2 /M) /( G0 /G1 + S + G2 /M) × 100%

　　1.5.3 细胞凋亡检测收集药物作用24h 的细胞，用500μlBinding Buffer 洗涤1 次， 120 目筛网过滤，静置10min 后离心，弃去上清后加入10μl Annexin V-FITC 和50μl PI，混匀避光孵育15min 后离心，弃上清后用500μl 流式PBS 重悬细胞，上机检测细胞凋亡情况。

　　1.5.4 mRNA 表达检测取对数生长期细胞种6 孔板，培养24h 后加药，设置空白对照组、溶剂对照组和IC50浓度的GS-Rh2实验组，每组设2 个复孔。继续培养24h 后，弃去培养液，用预冷的PBS 洗涤1 次，弃去PBS 后加入1ml Trizol 并收集细胞，按说明书操作提取总RNA，用紫外分光光度计测定A260 /A280，计算RNA 样品的纯度和浓度。按说明书操作合成cDNA，以适量cDNA 为模板在Taq DNA 聚合酶催化下进行PCR 扩增。按照SYBR Premix Ex TaqTM 试剂说明进行real time-PCR 反应，反应体系20μl，每份样品做复孔检测扩增条件为: 预变性95℃30s，PCR 反应95℃ 5s， 60℃ 30s， 40 个循环后60℃延伸34s。mRNA 相对表达量用比较CT 值法计算，以看家基因磷酸甘油醛脱氢酶( Gapdh) 为内参，即用看家基因和靶基因CT 值差( ΔCt) 计算靶基因相对看家基因Gapdh 表达量( 1 /( 2ΔCt) ) ，以对照组作比较基准，计算实验组mRNA 的相对表达量( Ratio) 。引物应用Invitrogen 公司在线软件OligoPerfect? Designer 设计，用BLAST 进行比对，由Invitrogen 公司合成，实验用引物相关情况见表1。

　　1.5.5 统计学方法spss19.0 软件包进行统计学处理。mRNA表达采用t 检验，P≤0.05 为差异有统计学意义; 其余实验数据采用平均值法。

　　2 结果

　　2.1 GS-Rh2 对T24 细胞的增殖影响实验发现，GS-Rh2 在5～ 20mg /L 浓度无抑制作用，其对T24 无抑制作用的最大浓度为21.97mg /L，根据图表公式求出IC50≈37.00mg /L。为获得更为稳定的实验结果，减少实验误差，后续实验取40mg /L 浓度进行。

　　2.2 GS-Rh2 对T24 细胞形态学的影响光学显微镜下观察所得，空白和溶剂对照组T24 细胞密度大，数量多，呈梭型，有触角。经40mg /L GS-Rh2 处理24h 后的细胞多呈圆形，密度减少，胞膜变圆滑没有触角，胞质减少，折光度减弱，核皱缩颜色变浅，细胞体积缩小，并有大片细胞脱落，如图2。

　　2.3 GS-Rh2 对T24 细胞周期的影响与溶剂对照组相比，40mg /L GS-Rh2 作用24h 后实验组G0 /G1 期细胞所占比例明显上升，G2 /M 期和S 期细胞比例均下降( 如图3 所示) 。对照组和实验组的增殖指数PI 值分别为42.534%和31.030%。

　　2.4 GS-Rh2 对T24 细胞早期凋亡的影响对照组有部分细胞出现早期凋亡，这可能与细胞本身状态有关。实验组细胞( 40mg /L GS-Rh2 作用24h) 早期凋亡率比溶剂对照组上升10.9%，有明显差异，如图4。

　　2.5 GS-Rh2 对T24 细胞p53、myc 基因mRNA 表达的影响与溶剂对照组比较，实验组( 40mg /L GS-Rh2 作用24h) mRNA的表达发生显著改变，p53 和myc 表达水平显著降低。myc 对照组和实验组的x ± SD 分别为1.0265 ± 0.0375、0.3705 ± 0.0262，p53 对照组和实验组的x ± SD 分别为1.2055 ± 0.2906、0.8265 ± 0.1450，如图5。

　　3 讨论

　　GS-Rh2 是人参的活性成分，其通过调节免疫功能、抑制肿瘤转移、诱导癌细胞凋亡、逆转肿瘤细胞的耐药性、诱导癌细胞分化并抑制癌细胞生长等机制发挥其抗癌作用。GS-Rh2 抗肿瘤作用具有多靶点、多效应的特点，同时其不良反应少，不易产生耐药性，是近年来研究的热点。本实验通过研究GS-Rh2对体外培养人膀胱癌细胞T24 的作用，证实GS-Rh2 有抑制膀胱癌细胞增殖并诱导其凋亡作用，为膀胱癌的临床治疗提供实验依据。细胞形态学变化是研究细胞增殖和凋亡不可或缺的一部分。结果显示，经过GS-Rh2 24h 作用后的T24 细胞出现了明显的形态学变化，细胞密度减少，细胞体积缩小，并有大片细胞脱落。实验中采用MTT 法研究并证实GS-Rh2 对T24 细胞有抑制增殖的作用，其半数抑制浓度IC50为37.00mg /L。其中在5 ～21.97mg /L 浓度范围内抑制率没有明显差异或无抑制作用，而21.97 ～ 160mg /L 浓度内GS-Rh2 能呈量-效关系显著抑制细胞增殖并诱导其凋亡。

　　研究表明，DNA 受损的细胞通过以下方法避免DNA 复制:停滞在G1 期; 或者是在细胞已经通过G1 期的限制点后，通过抑制复制子的起始或延伸，暂时停滞在S 期。Ota 等检测到GS-Rh2 可使黑色素瘤B16 细胞的细胞周期阻滞于G1 期。本实验证明，GS-Rh2 能使T24 细胞周期阻滞于G1 期，G2 期和S 期细胞明显减少。由此可推测，GS-Rh2 可阻止细胞进行DNA复制，抑制细胞分裂。结果显示T24 细胞经GS-Rh2 作用24h 后其增殖指数由42.534% 下降至31.030%，因此GS-Rh2 能使细胞增殖指数降低。Annexin V 是一种分子量为35-36kD 的Ca 依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的膜磷脂酰丝氨酸( PS)高亲和力特异性结合，利用此原理可检测细胞的早期凋亡。实验结果显示，实验组早期凋亡细胞较对照组增加10.9%，差异显著，因此表明GS-Rh2 对T24 细胞有诱导凋亡的作用。myc 基因是较早发现的一组癌基因，编码细胞核磷酸蛋白，参与转录调节。c-myc 的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，其过度表达与膀胱癌的恶性程度密切相关，膀胱移行细胞癌病理分化越低，c-myc 癌基因蛋白表达率越高，患者临床预后越差。本实验结果显示，GS-Rh2 能使myc 基因表达显著下降，这可能是GS-Rh2 诱导细胞凋亡的机制之一。野生型p53 是常见的抑癌基因，通过其核心区结合DNA，阻止细胞从G1 期进入S 期，此时间间隔组织了细胞周期素与CDK 的相互作用，允许损伤的DNA 被修复。在此过程中，p53在核内启动p21 的转录，而p21 结合并阻止CDK2 的作用。但突变型p53 却能加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、阻滞癌细胞凋亡等。由于细胞内野生型p53 蛋白稳定性被严格控制，半衰期只有6 ～ 20min，而突变型p53 蛋白在癌细胞中高水平堆积并具有较长的半衰期( 1 ～ 24h) ，从而容易被检测到。李俊鹏等研究表明，p53 在正常膀胱黏膜中无表达，在膀胱移行细胞癌组织中明显表达，其阳性率随膀胱移行细胞癌病理分级增高而增高，随临床分期增加而增高，且p53 与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期呈正相关，因此p53 可作为判断膀胱移行细胞癌恶性程度和预后的重要指标。本实验结果显示GS-Rh2 能使p53 基因表达显著下降，因此推断GS-Rh2 能促进T24 细胞发生早期凋亡可能与其使p53 表达下降有关。综上所述，GS-Rh2 能显著抑制体外培养人膀胱癌T24 细胞增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与GS-Rh2 阻滞T24 细胞进入S /G2 期和使myc、p53 基因表达下降有关。