人参皂甙单体Rh2对人脑胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响及其机制探讨

　　人参皂甙单体Rh 2对人脑胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响及其机制探讨

　　张继全,邱建武,关宁,张晓健

　　(辽宁医学院,辽宁锦州 121001)

　　摘要: 目的　观察人参皂甙单体 Rh2 ( GSRh2 )对人脑胶质瘤 U251细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。

　　方法:用GS-Rh2 处理人脑胶质瘤 U251细胞 ,采用 M TT法检测 U251细胞增殖抑制率 ,流式细胞仪和 Annexin VF ITC / P I双染法观察 U251细胞凋亡情况 , TRAPEL ISA 法检测 U251细胞端粒酶活性 ,RTPCR法检测U251细胞人端粒酶逆转录酶hTERT mRNA 的表达。结果5、10、20、40、80g/m l GSRh2 组 U251细胞增殖抑制率分别为 20. 42% 、32. 19% 、45. 09% 、57. 37% 、73. 82% 。根据细胞增殖抑制曲线计算出 IC、IC、IC值分别为 9. 7、25. 2、30 50 70 68. 4 μg/m l。F ITC和 P I荧光双参数点图显示实验组细胞分布区域与对照组相比出现明显改变 ,随着药物浓度的增加 ,早期凋亡、晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。9. 7、25. 2、68. 4 μg/m l GSRh 处理 12、24、48、72 h 后U251细胞端粒酶活性随 GSRh 浓度增加和作用时间的延长而降低。浓度为 25. 2g/mlGSRh作用24、48、72 h 2 2的 U251细胞 hTERT mRNA 与actin灰度值比为 0. 964 9 ±0. 004 2、0. 401 8 ±0. 001 4、0. 297 8 ±0. 001 8,对照组 为0. 976 4 ±0. 005 1。作用 48、72 h U251细胞 hTERT mRNA 与actin灰度值比与对照组相比 P 均 < 0. 05;作用 48、72 h者相比 P < 0. 05。结论　GSRh2 能够诱导人脑胶质瘤 U25l细胞凋亡 ,抑制 U25l细胞增殖。其机制与其抑制 hTERT基因表达 ,降低端粒酶活性有关。

　　关键词:人参皂甙单体 Rh2 ;胶质瘤;细胞增殖;细胞凋亡;端粒酶;人端粒酶逆转录酶

　　中图分类号: R739. 41　　文献标志码:A　　文章编号: 1002266X (2010) 22001603

　　Effect and m echan ism o f g in seno side R h2 on hum an g liom a U 25 1 ce ll p ro life ra tion and apop to sis ZHAN G J iquan, Q IU J ianw u, GUAN N ing, ZHAN G X iaoj ian (L iaon ing M ed ica l Un iversity, J inzhou 121001, P. R. Ch ina) Abstract: O bjective　To ob serve the effect and mechanism of ginsenosideRh2 ( GSRh2 ) on human glioma U251 cell p roliferation and apop tosis. M ethods　Human glioma U251 cellswere treated w ith GSRh , the inhibitory effect was exam ined w ith M TT. Staining w ith Annexin V F ITC / P I and flow cytometry analysis were u sed to detect the apop totic cells.

　　TRAPEL ISA was u sed to detected telomerase activity and RTPCR was u sed to detect the exp ression of hTERT gene. Re sults　The apop totic rate was 20. 42% in the group w ith 5 g/m l GSRh2 , 32. 19% in the group w ith 10 g/m l GSRh2 , 45. 09% in the group w ith 20 g/m l GSRh2, 57. 37% in the group w ith 40 g/m l GSRh2, 73. 82% in the group w ith 80 g/m l GSRh . The value of IC , IC , IC were 9. 7, 25. 2, 68. 4 g/m l respectively. F ITC and P I fluorescence dualpa 2 30 50 70 rameter point map showed that there was a significantly change between the regional distribution of experimental cells com pared w ith control group , and early apop tosis, late apop tosis or necrosis of regional cells gradually increased w ith the in crease of drug concentration. The telomerase activity of U251 cells which treated with 9. 7, 25. 2, 68. 4 g/m l GSRh2 de creased w ith the concentration of GSRh2 and the treatment time. The grey ratio of hTERTmRNA and actin in U251 cells treated w ith 25. 2 g/m l GSRh2 for 24, 48, 72 h were 0. 964 9 ±0. 004 2, 0. 401 8 ±0. 001 4, 0. 297 8 ±0. 001 8 respec tively, and it was 0. 976 4 ±0. 005 1 in control group. Conclusion s　GSRh2 can induce human glioma U251 cell apop to sis, inhibite cell p roliferation. It may be related to GSRh2 decreasing hTERT gene exp ression and inhibiting telomerase ac tivity. Key words: ginsenosideRh ; glioma; p roliferation ; apop tosis; telomerase; human telomerase reverse transcrip tase

　　文献报道人参皂甙单体 Rh2 ( GS-Rh2 )具有较强的抗肿瘤生物活性 ,对卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、白血病以及人肺腺癌等肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。国外研究表明,这种抗肿瘤作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关[ 5 ] 。国内相关报道较少。2009年 3～7月,我们检测了 GSRh2对胶质瘤 U251细胞增殖和凋亡及端粒酶活性、人端粒酶逆转录酶hTERT mRNA 表达的影响。现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1. 1 　材料 　人脑胶质瘤 U251 细胞株, Rh DMEM 培养基 ,胎牛血清 ,MTT、DM SO、RTPCR2试剂盒 , Annexin V F ITC / P I 双染试剂盒 , TRAPEL ISA 试剂盒 ,多功能电泳仪 , PCR 仪 , B iorad凝胶成像系统 ,流式细胞仪。

　　1. 2　方法

　　1. 2. 1　U251细胞增殖抑制率的测算 　采用 MTT法。取对数生长期 U251细胞接种于 96 孔培养板(1×104)孔。加入终浓度分别为 0(对照组)10、20、40、80 g/m l 的 GSRh ,每孔设 4 个复孔。37 ℃、5% CO2 孵箱中培养 48 h。每孔加入 5 mg/m l MTT溶液 20 l,继续培养 4 h后加入 DM SO 150酶联免疫检测仪 570 nm 波长处测定吸收度 OD 值。细胞增殖抑制率 = ( 1 - 加药组 OD 值 /对照组 OD值) ×100% 。绘制细胞增殖抑制曲线图,横坐标为GSRh2浓度 ,纵坐标为细胞抑制率 ,计算 IC 30 IC50 IC70。

　　1.2.2 U251细胞凋亡情况的观察 采用Annexin V-FITC/PI双然法和流式细胞术。收集浓度为IC 30、IC50、IC70 的GS-Rh2作用48h的实验组和对照组U251细胞。调待测细胞浓度为1×106 /ml。去1ml细胞，1000r/min，4℃离心10min，弃上清，再加入1ml的冷PBS同法离心，弃上清，将细胞重悬于200μ1Binding Buffer中，加入10μ1Annexin V-FITC和5μl PI,轻轻混匀后避光4℃反应30min;最后加入300μl Binding Buffer用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

　　1.2.3 U251 细胞端粒酶活性的检测 采用TRAP-ELISA法。收集药物浓度为IC 30 IC50 IC70 作用12,24,48，72h的实验组和对照组251细胞，分别加入200μl细胞裂解液，取上清液并根据试剂盒提供的引物和预设PCR程序进行端粒序列扩增，将扩增产物顺序进行杂交，显色处理后室温放置20min，最后加入100μl反应终止液,制备的样本用酶联免疫检测仪分别测450nm和690nm波长的OD值，两者差值代表细胞端粒酶活性。以U251细胞提取液于65℃加热10min后为阴性对照，以人胚肾293细胞株端粒酶提取液为阳性对照。

　　1.2.4 U251细胞hTERTmRNA的检测，采用RT-PCR法。分别取对照组和浓度为IC50 GS-Rh2作用24,48,72h的实验组U251细胞，提取各族细胞总RNA，逆转录制备cDNA，然后进行聚合酶链反应(PCR)。操作按试剂盒说明书进行。利用图像分析软件Gene Tools 分析各组hTERT、β-catin两条基因条带的灰度比。

　　1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据用x ±s表示。两样本均数比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2. 结果

　　2.1 U251细胞增殖抑制率5、10、20、40、80μg/ml GS-Rh2组U251细胞增殖抑制率分别为20.42%，32.19%，45.09%，57.37%，73.82%。根据细胞增殖抑制曲线计算出IC 30、IC50、IC70 值分别为 9.7、25.2、68.4μg/ml。

　　2.2 U251细胞凋亡情况 FITC和PI荧光双参数点图显示对照组细胞主要分布在坐下象限的活细胞去，实验组细胞分布区域出现明显改变，随着药物浓度的增加，早期凋亡，晚期凋亡或坏死的区域细胞数量逐渐增多。

　　2.3 U251细胞端粒酶活性 对照组和9.7、25.2、68.4μg/ml GS-Rh2组U251细胞培养0、12.、24、48、72h端粒酶活性见表1.

　　2.4 U251细胞hTERTmRNA浓度为25.2μg/ml GS-Rh2作用24、48、72h的U251细胞hTERTmRNA于与β-actin灰度值比为0.9649±0.0042、0.4018±0.0017、0.2978±0.0018，对照组为0.967±0.0051。作用48、72hU251细胞±于β-actin灰度值比与对照组相比P均<0.05;作用48、72者相比P<0.05。

　　3 讨论

　　人参为五加科多年生草本植物 ,是有着近几千年应用历史的名贵中药。GSRh2 是从人参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。大量研究表明, GSRh2在肿瘤的预防和治疗方面具有较强的活性 , GSRh2的抗肿瘤作用较为广泛 ,既可阻滞细胞周期 ,诱导癌细胞凋亡和抑制肿瘤的生长或诱导细胞分化使其逆转 ,抑制肿瘤的转移 ,影响和调节免疫功能,增强机体对疾病的抵抗能力 ,从而抑制肿瘤的能抑制 hTERT生长 ,还可增强抗癌药的药效[ 1]。GSRh2用具有多靶点、多效应的特点, 同时其不良反应少 , 不易产生耐药性 ,是近年来研究的热点。肿瘤主要发生机制之一是细胞正常的有限生命周期缺陷,使细胞永生化。端粒酶的激活是细胞永生化的关键步骤.无限增殖和凋亡抑制是肿瘤U251细胞凋细胞共有的特征 , 由此引起的细胞异常蓄积是肿瘤抑制发生、发展 的中心环节[ 3 ] 。Kyo 等[4 ] 研究表 明hTERT是端粒酶活性的限制性成分 , hTERT的表达与端粒酶激活和肿瘤发展存在着密切关系。本研究用机制的研究进展 [ J ]. 结果显示 ,在体外 GSRh2对人脑胶质瘤 U251细胞oncologist: cellular增殖有明显抑制作用 , IC50为 25. 2 μg/m l。通过流式细胞仪检测细胞凋亡的荧光双参数点图发现 ,各实验组细胞分布区域发生了明显变化 ,并且随着药基因表达对其增殖及物浓度增加活细胞的分布区域细胞数量逐渐减少 , 而凋亡早期、凋亡晚期或坏死区细胞数量相应增多。表明 GSRh2能够抑制人脑胶质瘤 U25l细胞增殖 , 诱导 U25l细胞大量凋亡 ,且凋亡早期细胞数量尤为胞 hTERT表达及端明显。端粒酶 的活性表现是人端粒酶逆转录酶 hTERT 以人端粒酶 RNA hTR为底物合成端粒序列维持端粒在一定长度 ,稳定染色体结构 ,使细胞成为永生性细胞[ 5 ] 。hTERT是端粒酶活性的限速因素 , 在端粒酶阳性的肿瘤中常见 hTERT 高表达。hTERT基因表达可以反映端粒酶活性与hTERT mRNA 水平 ,端粒酶激活与凋亡调控失控同为肿瘤恶性转化的早期事件[ 7 ] 。本研究结果显示, GSRh2对人脑胶质瘤细胞的抑制作用。GSRh2可以抑制细胞的端粒酶活性变化 ,实验组随着时间延长和剂量加大端粒酶活性逐渐降低 ,并呈现时间和剂量依赖性关系,通过药物抑制端粒酶催化亚单位 hTERT 的表达 ,可降低端粒酶活性 ,最终导致肿瘤细胞死亡 , 从而达到治疗肿瘤的目的。hTERT mRNA 水平与端粒酶活性密切相关 , hTERT的激活对肿瘤细胞中端粒酶活性的激活是必需和足够的, hTERT的表达是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤[ 8 ] 。本实验通过琼脂糖凝胶 电泳获得hTERT基因扩增条带表明, GSRh2mRNA 的表达水平 , 图像分析软件显示实验组与对照组相比较扩增条带灰度比有显著性差异 ,并随着药物作用时间的延长 hTERT mRNA 的表达量越来越少。因此 ,利用 hTERT启动子的癌细胞相对特异的转录活性 ,可将其作为肿瘤基因治疗靶标[ 9 ] 综上所述 , GSRh2亡 , 抑制其增殖。其机制可能与hTERT基因表达 ,降低端粒酶活性有关。GSRh2促进人胶质瘤U251细胞凋亡 , 抑制其增殖。其机制可能与GSRh2hTERT基因表达 ,降低端粒酶活性有关。