人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞的体外抑制作用

　　人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞的体外抑制作用

　　王占峰,罗毅男,洪新雨,鞠砚,付双林,郭海涛,李 叶,韩海玲,孙玉芹

　　[ 摘 要]目的: 比较人参皂苷Rh2、榄香烯与阿霉素对胶质瘤细胞的体外抑制及凋亡诱导作用, 以及药物杀伤的时效关系。方法: 体外培养胶质瘤细胞, 用MTT肿瘤体外药敏法比较人参皂苷Rh2、榄香烯与阿霉素对胶质瘤细胞系C6、SHg44、U251的抑制作用, 并绘制细胞存活率时间曲线。用流式细胞术检测3种药物作用后细胞凋亡情况。结果: 3种药物对胶质瘤细胞系C6、SHg44、U251的抑制作用呈明显的剂量依赖性, 随浓度的增加而增强。人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞系的抑制作用明显高于榄香烯和阿霉素, 与后两者比较差异有显著性( P < 001) 。3种药物对胶质瘤细胞的抑制作用均呈时间依赖关系, 随时间延长而增强, 且低浓度的人参皂苷Rh2短时间( 12 h) 就有生长抑制作用, 而榄香烯和阿霉素的起效时间较缓慢。3种肿瘤细胞经低浓度的3种药物作用后均可出现凋亡, 其中人参皂苷Rh2凋亡细胞比率明显高于其他两组, 差异有显著性 ( P < 001) 。

　　结论:人参皂苷Rh2对胶质瘤具有较好的生长抑制和凋亡诱导作用, 起效时间早于榄香烯和阿霉素。人参皂苷Rh2 良好的抑瘤效果和迅速的起效时间具有应用于胶质瘤治疗的潜在价值。

　　[ 关键词]神经胶质瘤; 人参皂苷; 榄香烯; 阿霉素; 细胞凋亡

　　Inhibitory effect of ginsenosideRh2 on glioma cells cultivated in vitro

　　WANG Zhanfeng , LUO Yinan, HONG Xinyu , JU Yan , FU Shuanglin , GUO Haitao , LI Ye , HAN Hai ling , SUN Yuqin

　　( 1. Department of Neurosurgery, First Hospital, Jilin University, Chang hun 130021, China; 2. Department of CardioCerebral and Vas ular Medi ine, Affiliated Hospital, Medi al College, Beihua University, Jilin 132011, China) Abstract: Objective T o ompare the inhibitory effe ts of ginsenosideRh2 , elemene and adriamy in ( AMD) on glioma ells ultivated in vitro . Methods M TT was used to dete t the inhibitory effe ts of ginsenosideRh , elemene and AMD on glioma ell lines ( C6, SHg44, U251) . The survival ratetime urves were established. The abilities of three drugs to indu e apoptosis of three ells lines were determined by flow ytometry. Results The inhibitory effe ts of the three drugs on the growth of C6, SHg44 and U251 were dosedependent and ould be enhan ed with dose in reasing. The inhibitory effe ts of Rh2 was stronger than that of AMD and elemene on three glioma ell lines. The inhibitory on entration of Rh2 on three ell lines was signifi antly lower than that of AMD and elemene ( P < 001) , the inhibitory effe ts of three drugs demonstrated time and dose dependen y and ould be enhan ed with time prolonging. Rh2 exhibited growth inhibition on glioma ells at low on entration in short time ( 12 h) , elemene and AMD took effe t slowly, whlie Rh2 exhibited higher apoptoti rate than other two drugs (P < 001) . Conclusion GinsenosideRh2 an exhibite ex ellent a tivity of growth inhibition。and apoptosis indu tion on glioma ells. It s re ommend for further lini al study in glioma treatment.

　　Key words: glioma; panaxosides; elemene; adriamy in; apoptosis

　　普通的化疗药物有较强的毒副作用并易产生抗药性。目前，来源于动、植物的天然化合物称为研究抗癌药物的主要方向，人们致力于寻求抑制肿瘤发生和转移的新天然药物。人参皂苷Rh2，属于二醇组皂苷，是由人参中提取的天然活性成分。近期有研究表明，Rh2对胶质瘤细胞的抑制作用与榄香烯和阿霉素进行比较，为进一步研究及临床应用提供依据。

　　材料与方法

　　1.1 细胞株 3种胶质瘤细胞株C6，SHg-44和8-251由本校基础医学院生化与分子生物学教研室冻存。

　　1.2药物 人参皂苷Rh2由本校基础医学院天然药物化学研究室分离提纯，乙醇及吐温80-助溶，三蒸水溶解稀释，4℃保存待用。榄香烯乳注射液由大连金港制药公司生产(批号：0412141)。阿霉素(Doxorubicin,AMD)由中科院长春应用化学研究所徐慧玲博士惠赠。试验中药物浓度按相关文献和临床用药量计算不同药在体内的血浆峰值浓度Cmax ，采用生理盐水支撑高浓度储存液保存在低温冰箱内。实验中3种药物均按倍数递增、递减，药物分成4个浓度(32/16/8/4μmol·L-1)进行检测。

　　1.3试剂 MTT[四甲基偶氮唑蓝，3-(4,5,-dimthy-2 -2 thiazoly)2,5-dipheny-2H-tet razoliun bromide,美国生产，保泰克试剂公司分装];结晶紫燃料(分子式C25H30N3Cl，瑞典生产，保泰克试剂公司分装)配置成0.1%的储备液，pH=5。

　　1.4检查仪器 DG3022酶联免疫检测仪(日本);FACSCalibur流式细胞仪(美国生产)。

　　1.5MTT法 消化培养中处于对数生长期的C6胶质瘤细胞(台盼蓝染色后用血球计数板进行细胞计数，活细胞在90%以上)制成5*105·mL-1细胞悬液，接种于96孔平板，没孔5*104个细胞悬液100μL，同时分别加入上述4中浓度的Rh2、榄香烯与阿霉素100μL培养48h，洗出120μL上清液，每孔加入5g·L-1 MTT溶液20μL，每组设6副孔，同时设置对照及空白凋零组。孵育4h，是MTT还原为蓝色结晶物Formazan，加入DMSO100μL，平板并计算抑制率。抑制率(%)=[(对照组A组-实验组A组)/对照组A组]*100%。

　　1.6药物作用时间-效果研究 将3种细胞接种入96孔板中，每孔5*104个细胞。培养液过夜贴壁后，分别加入低浓度的3种药物，对照组不加药物。分别取6个试点测定组和对照组的吸光度值计算细胞存活率，计算并绘制细胞存活率时间线。肿瘤细胞存活率(%)=实验组A组/对照组A值*100%。

　　1.7半抑制浓度(IC50)的计算 IC50定义为使加药组吸收值降低至对照组的50%时所用药物的浓度。根据实验结果绘制细胞对药物的浓度反应曲线，经线性方程球的IC50.

　　1.8流式细胞术分析 C6，SHg-4和U-251 3种胶质瘤细胞5*104接种于25cm2 培养液中。24h后分别加入终浓度为(4μmol·L-1)的Rh2,72h后手机但细胞悬液，70%乙醇固定过夜，RNA酶消化30min，PBS洗涤2次，个5min，离心后细胞重悬与碘化丙啶染液，30min后用激光激发检测荧光，分析细胞周期和凋亡峰。细胞周期变化数据及凋亡细胞变化数据用ModifitLTTM软件分析。

　　1.9统计学处理 药物对胶质瘤细胞半数抑制浓度IC50和相关指数(R2)采用SPSS1.0统计软件Probit概率回归法计算;IC50值，结果的比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 3种药物对3种胶质瘤细胞的生长抑制作用的MTT检测结果 人参皂苷Rh2，榄香烯、阿霉素对3中胶质瘤细胞的生长抑制作用呈现明显的计量依赖性，相关指数R2 >0.08;人参皂苷对胶质瘤细胞系的抑制作用明显高于榄香烯和阿霉素，其IC50仅相当于榄香烯和阿霉素的1/3~1/6，与后2者差异具有显著性(P<0.01);榄香烯与阿霉素的抑制作用相当，两者IC50蝉翼无显著性(P>0.05)，见表1。

　　2.2 3种药物作用时间与作用效果比较 3种药物对3中胶质瘤的抑制作用均呈时间依赖关系。Rh2在低浓度(4μmol·L-1)下即产生抑制作用，72h后胶质瘤细胞存活率为50%-70%。榄香烯和阿霉素起效时间较缓慢(24-36h)，72h后存活率较Rh2高10-20%(见图1-3)

　　2.2 流式细胞仪检测结果 对照组的3种胶质瘤细胞有少量细胞发生凋亡;3种胶质瘤细胞经3种药物较低浓度(4μmol·L-1)处理后的凋亡比例均升高，其中人参皂苷Rh2组的细胞凋亡比例明显高于榄香烯和阿霉素组，差异均有显著性(P<0.01),见表2.

　　3 讨论

　　人参皂苷Rh2是从人参皂苷中提取的天然成分，毒性低，已用于多种肿瘤的基础研究。它属于小分子物质且为脂溶性，容易通过血脑屏障，无骨髓抑制，不易产生耐药、能改善机体免疫功能，对正常组织毒性甚低。其特性适合于脑肿瘤。Rh2能有效地动员肿瘤细胞由G0/G1 期进入S期，同时，又能阻止S细胞进去G2/M期，导致细胞在S期阻滞，从而抑制细胞增殖并且提高化疗效果，而且对正常细胞不良反应小。

　　本研究结果表明，人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞系的抑制作用明显高于榄香烯和阿霉素，其IC50仅相当于榄香烯和阿霉素的1/3~1/6，榄香烯和阿霉素对胶质瘤的抑制作用相当。同时进一步研究发现，Rh2对胶质瘤的生长抑制作用具有良好的时效性，低浓度概要在短时间即可产生生长抑制作用。

　　细胞凋亡是通过基因调控的细胞自杀现象，在正常组织分化和肿瘤治疗中具有重要意义，因此，肿瘤的治疗在某种程度上而言，就是诱导肿瘤细胞凋亡的过程。许多抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡达到的。本研究表明Rh2在低浓度(4μmol·L-1)时可诱导胶质瘤细胞发生凋亡。凋亡细胞比例明显增加，而同剂量的Rh2诱导凋亡作用明显强于榄香烯和阿霉素，有关研究证实Rh2诱导凋亡作用机制通过诱导caspase激活通路使肿瘤细胞SKHRP-1出现凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长。

　　综上所述，本实验结果表明，Rh2具有较好的生长抑制和诱导凋亡作用，作用效果优于阿霉素和榄香烯。该药良好的抑瘤效果和较短的起效时间对于提高胶质瘤的临床疗效，减少不良反应意义重大，值得在基础和临床研究中进一步探讨。

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