人参单体皂甙Rh2对前列腺癌细胞株PC-3M细胞移行周期的影响

　　[摘　要]　目的:探讨Rh2对体外培养的PC-3M细胞移行周期的影响。方法:应用[3H]-TdR掺入法和流式细胞仪测定DNA含量及进行细胞周期的分析。结果:PC-3M细胞的[3H]-TdR掺入量明显少于对照组(P<0·01);流式细胞仪测定G1期细胞数百分比明显高于对照组。结论:Rh2可使PC-3M细胞增殖周期阻滞在G1期,肿瘤细胞增殖减慢。

　　[关键词]　前列腺肿瘤;人参;细胞周期

　　随着我国老年人口的增加及临床医学诊断技术的提高,在我国前列腺癌的发病率也有逐年上升的趋势。而对前列腺癌的治疗一直未取得满意的效果。现代医学研究发现单体人参皂甙Rh2具有较强的抗肿瘤生物活性,对黑色素瘤、卵巢癌等肿瘤细胞的生长具有抑制作用。但Rh2对前列腺癌的作用尚未见文献报道。前期研究工作发现Rh2可明显抑制PC-3M细胞的生长。本文拟用[3H]-TdR掺入法和流式细胞术观察Rh2对PC-3M细胞移行周期的影响。

　　材料和方法

　　1　细胞株及培养条件

　　PC-3M细胞株系人激素非依赖性前列腺癌细胞株。细胞培养在含有10%小牛血清的IMDM培养液中,传代用0.25%的胰酶消化后分瓶,每周传代2次。

　　2　药品与试剂

　　人参单体皂甙Rh2为本校药学院天然药物化学教研室分离提纯,并制成试剂,浓度为20 g/L。用时以PBS溶液稀释。[3H]-TdR购于中国科学院上海原子核研究所。RNA酶为BochringerMannheim产品,碘化丙锭(propidium iodide, PI)为美国Sigma公司产品。

　　3　 方法

　　3.1 [3H]-TdR掺入实验([3H]-TdR incorporationassay)

　　细胞接种于96孔无菌培养板,每孔10μL,细胞数1×104/孔。实验组加不同浓度Rh2PBS溶液,对照组加PBS溶液,终体积为200μL,每组设4复孔。置37℃、5%CO2孵箱中培养24 h,于结束培养6-8 h前加入[3H]-TdR,每孔5μL (3·7×107Bq/L)。培养结束时,取出培养板,弃掉培养液,Hanks液洗3次,胰酶消化后,加培养液中止消化,收集细胞于玻纤滤纸上,用液闪仪测定counts·min-1值,即用counts·min-1值表示[3H]-TdR的掺入量。

　　3.2　流式细胞术(flow cytometry, FCM)

　　①细胞培养及固定　传代培养的细胞经0.25%胰酶消化后,计数,台盼蓝拒染法测得活细胞数为90%以上。将细胞接种于培养瓶中,每瓶5×106个细胞,同时加药,Rh2的终浓度为5、10 mg/L,对照组加等体积PBS。每瓶终体积为4 mL。作用24 h后,收集细胞,离心,留肿瘤细胞悬液0.5~1 mL,加3mL pH7.4的磷酸缓冲液,离心,弃上清液,留0.5 mL的细胞悬液,吹打均匀,PBS洗两次。用细滴管或注射器将以上细胞悬液迅速注入4℃、70%的冷乙醇中,搅匀。4℃冰箱固定至两周。

　　②DNA染色-PI染色法　将用70%冷乙醇固定的细胞悬液离心后,弃乙醇。PBS洗两次,弃上清后留0.5 mL细胞悬液,用PBS将细胞密度调整为1×109/L。加入RNAase 0.5 mL(5 g/L),37℃消化30min。取出放入冰浴中,加入1.5 mL PI(50 mg/L)对DNA进行染色,30 min以上。用300目尼龙网过滤,上流式细胞仪,在波长488 nm,300 mW氩离子激光条件下,每份样品检测1×104个细胞,所得数据通过接口直接贮存在计算机上,实验后脱机进行运算,通过软件Multicycle进行分析,以DNA含量为横坐标, 受检细胞数为纵坐标作图,计算得各期细胞数。

　　4　统计学处理

　　实验结果统计处理采用ANOVA分析,Studentt检验,数据用-x±s表示。

　　结　　果

　　1　Rh2对肿瘤细胞DNA合成的影响

　　从表1可见,当用不同浓度的Rh2处理后,PC-3M细胞的[3H]-TdR掺入量明显少于对照组(P<0.01),其作用随着药物浓度的增大而增强(见表1)。

　　2　Rh2对PC-3M细胞移行周期的影响

　　经Rh2作用后,PC-3M各期细胞数百分比如表2。从表2可见,G1期细胞数明显增多,而S期细胞数减少,G1期细胞大量堆积。同时以DNA含量为横坐标,以受检细胞数为纵坐标,可得DNA直方图。与对照组比较,Rh2给药组G1峰增高,而S、G2期峰降低,在G1峰的前面出现一个小的亚2倍体峰(亦称为亚G1峰),即为凋亡峰,从表2可以看出Rh25mg/L、10 mg/L发生凋亡的百分率分别是6.8%和13.6%。明显高于对照组。

　　讨论

　　前列腺癌是老年男性常见肿瘤之一,目前对前列腺癌的治疗仍主要以手术切除和内分泌治疗为主。但均未取得满意的远期效果。从植物中开发抗肿瘤药物,已成为国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。夏丽娟等[3]利用体外实验证明Rh2在10 mg/L的浓度下能明显抑制黑色素瘤细胞B16的生长。而且可使B16细胞阻断在G1期,说明Rh2对黑色素瘤细胞B16具有分化诱导的作用。

　　Sherr认为哺乳动物的细胞周期受控于一组叫周期素的蛋白质(亦称为细胞周期蛋白,cyclin),现已发现有8种周期素(分别命名为cyclinA至cyclinH)。细胞周期蛋白有一特性,即其表达量随细胞周期不同时期的转换而改变。它作为生长因子的感受器,与周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)结合为外源信号的整合器,通过介导外源信号诱导蛋白磷酸化,从而调控细胞周期进程。Motokura等的研究表明细胞周期蛋白与人类原发性肿瘤关系密切,细胞周期蛋白将细胞周期、信号传导及癌变三者联系起来。

　　细胞增殖周期中最为关键的是DNA倍增和染色体复制的S期。DNA复制的关键在于DNA合成。在细胞增殖周期中,如果由于外界因素的作用使DNA合成减慢或者受到抑制,那么将会影响细胞周期的进程。因此细胞DNA复制的快慢与多少,也反映了细胞增殖活力的强弱。本文应用[3H]-TdR掺入实验研究了Rh2对肿瘤细胞DNA合成的影响。结果表明,PC-3M细胞的[3H]-TdR掺入率明显少于对照组,即DNA合成减慢。这可能是Rh2作用于细胞后,抑制了癌细胞的DNA复制和转录能力,DNA合成减少,肿瘤细胞增殖减慢或停止。流式细胞仪的检测结果也表明Rh2作用后DNA含量较多的S期细胞减少,而DNA含量较少的G1细胞增多。二者的结果是一致的。

　　目前多数学者认为,肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控的结果,也可能是由于细胞凋亡受阻。细胞凋亡调控失败,会引起细胞(尤其是基因突变细胞)过度增殖或凋亡减少,从而增加细胞恶变的潜能,导致肿瘤的发生。细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率。细胞究竟是增殖还是凋亡,受很多因素的影响,其中比较重要的一个因素即是细胞周期的调控,一些被阻滞于G1-S期限制点的细胞,可能通过启动其自身内部机制而引发细胞凋亡。研究证实Rh2具有诱导C6胶质瘤细胞、肝细胞瘤细胞等肿瘤细胞凋亡的作用。本文通过流式细胞仪检测了药物作用后肿瘤细胞移行周期的变化。表明Rh2给药组G1期细胞数百分比增大,S期细胞明显减少,提示PC-3M细胞被阻滞在G1期。在DNA直方图上可见G1峰之前出现亚G1峰,可能是被阻滞在G1的细胞通过启动其自身的内部机制而发生了凋亡。这与其他学者的研究结论一致。至于Rh2究竟通过何种途径诱导凋亡,至今尚无定论,Lukas等认为可能是通过cyclinD的表达下降,cyclin/CDK激酶系统活性降低,Rb蛋白磷酸化作用减弱,使细胞不能通过G1-S期的限制点而被阻滞于G1期,从而使肿瘤细胞的增殖受到抑制,诱导肿瘤细胞发生凋亡。虽然其作用机理还不十分清楚,但体外实验的结果是肯定的。