人参皂苷Rh2诱导前列腺癌PC-3M细胞凋亡及其对新基因GRIM-19表达的影响

　　邵月婷1,李　峰1,高丽芳1,孙连坤1,胡嘉弟2,李　扬1*,赵雪俭1

　　(1.吉林大学基础医学院病理生理学教研室吉林大学前列腺疾病防治研究中心,

　　吉林长春130021; 2.美国马里兰大学医学院,美国21201)

　　[摘　要]　目的:研究人参单体皂苷Rh2对激素非依赖性人前列腺癌细胞(PC-3M细胞株)的致凋亡作用及其对新基因GRIM-19表达的影响。方法:实验分为Rh2高剂量组(40 mg·L-1)、Rh2中剂量组(30 mg·L-1)、Rh2低剂量组(15 mg·L-1)及对照组(未加药组)。分别作用于PC-3M细胞24 h,吖啶橙染色观察其对PC-3M细胞的促凋亡作用; RT-PCR和Western blotting方法分别检测Rh2对PC-3M细胞GRIM-19 mRNA及其蛋白表达的影响。结果: Rh2高、中、低剂量组作用于PC-3M细胞24h吖啶橙染色均呈阳性结果。Rh2低剂量组出现典型“出芽”现象,细胞中出现致密鲜亮橙色斑点。对照组细胞呈均匀绿色; RT-PCR结果显示,GRIM-19 mRNA随Rh2浓度的增加表达逐渐增强, Rh2中、低剂量组与对照组比较差异具有显著性(P<

　　0·05), Rh2高剂量组GRIM-19 mRNA表达与对照组比较差异具有高度显著性(P<0·01)。Western blotting结果与RT-PCR结果相一致, GRIM-19蛋白随Rh2浓度的增加其表达逐渐增强, Rh2中低剂量组与对照组比较差异具有显著性(P<0·05), Rh2高剂量组GRIM-19蛋白的表达与对照组比较差异具有高度显著性(P<0·01)。

　　结论: Rh2诱导PC-3M细胞凋亡与上调GRIM-19基因和蛋白表达有关,其表达强度呈剂量依赖性。

　　[关键词]　前列腺肿瘤;细胞凋亡;人参皂苷; GRIM-19

　　[中图分类号]　R363　　[文献标识码]　A

　　前列腺癌是欧美男性仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤,尤其是前列腺癌由雄激素依赖性向非依赖性的转变,对于后者去势效果不好,极大地影响患者预后。本室对激素非依赖性前列腺癌的前期研究表明:人参皂苷Rh2能在体外诱导激素非依赖性人前列腺癌细胞株(PC-3M细胞)凋亡,并显著抑制其生长,且呈剂量依赖性[1]。目前对Rh2凋亡信号的研究大多集中在caspase通路上。为进一步探讨Rh2对PC-3M细胞的凋亡作用机制,本文作者重点从基因和蛋白水平观察Rh2对凋亡相关基因GRIM-19 (gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19)表达的影响,为药物治疗雄激素非依赖性前列腺癌提供基础实验依据。

　　1　材料与方法

　　1·1　主要试剂　IMDM培养基购于美国Gibco公司,胎牛血清、胰酶为Hyclone公司产品, MTT购于宝泰克公司; GRIM-19鼠抗人单克隆抗体由美国马里兰大学胡嘉弟教授惠赠;二抗、三抗为丹麦DAKO公司产品;吖啶橙购自Sigma公司;MMLV、dNTP为美国Promega公司产品, Trizle试剂为北京鼎国生物公司产品。

　　1·2　细胞培养、药物处理及分组　人高转移性激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M由本室保存。PC-3M细胞复苏后接种于含10%胎牛血清的IMDM培养液中, 37℃、5% CO2条件下常规培养。待细胞长满至80%~90%培养瓶时,换用无血清的IMDM培养液继续培养24 h,使细胞同步化后进行实验。根据本室前期实验结果,选择Rh240 mg·L-1(高)、30 mg·L-1(中)、

　　15 mg·L-1(低)及对照组(未加药组)作为后续实验分组。Rh2储存液以无血清IMDM培养基

　　稀释为所需浓度。

　　1·3　吖啶橙(acridine orange, AO)染色　Rh2高、中、低剂量作用PC-3M细胞24 h后,分别取细胞悬液各95μL (细胞浓度为1×106·mL-1加AO染料5μL (0·1 g·L-1吖啶橙溶液, PBS配制)混匀,取20μL吖啶橙滴于载玻片上,其上覆盖玻片,即刻荧光显微镜下观察,拍照记录。

　　1·4　GRIM-19基因的RT-PCR半定量分析　分别取对数生长期PC-3M细胞(1~2)×106, Rh2作用24 h后,各加入Trizol 1 mL,按说明书操作提取总RNA。紫外分光光度计测定A260、A280以计算RNA样品的浓度及纯度。取1·0μg总RNA,Oligo为引物进行逆转录。GRIM-19上游引物:5′-GAGTCACGCACTGTCTGGG-3′,下游引物:5-CGGTCGGTTTCTGCCTGTA-3′,扩增片段为485 bp,由上海生工公司合成。β-actin作内参对照。PCR热循环条件: 94℃、30 s, 55℃、30s,72℃、90 s, 30个循环后72℃延长5 min。取PCR产物做琼脂糖凝胶电泳检测,紫外线下凝胶扫描、拍照,通过GIS数码凝胶成像系统测定电泳条带灰度,以目的基因与内参β-actin比值确定其含量。实验重复3次。

　　1·5　GRIM-19蛋白分析　Western blotting分组同前,裂解各组细胞并提取总蛋白,测定蛋白浓度(Bio-Rad),取50μg蛋白经15% SDS-PAGE电泳分离, Western blotting检测GRIM-19蛋白表达。GIS数码凝胶成像分析系统分析Western blotting杂交带光密度值,各组分别以对照组作为内参进行比较。

　　1·6　统计学处理　数据以x±s表示,应用SPSS12·0软件进行方差分析。

　　2　结　果

　　2·1　PC-3M细胞的吖啶橙染色　荧光显微镜观察(OLYMPUS BX50F4 )发现, Rh2低剂量组15 mg·L-1吖啶橙染色即呈阳性, PC-3M细胞呈团缩状或碎裂串珠状,胞核和胞浆可见颗粒状橙黄色染色,胞膜粗糙,有典型“出芽”现象(图1A和B,见封二),提示细胞出现早期凋亡; Rh240 mg·L-1组细胞形态不规则,细胞中出现致密187鲜亮橙色斑点(图1C,见封二)。对照组细胞未见明显凋亡表现,细胞形态规则,呈均匀绿色(图1D,见封二)。

　　2·2　Rh2诱导PC-3M细胞凋亡对GRIM-19基因表达的影响　RT-PCR分析结果显示,随着Rh2浓度的增加GRIM-19 mRNA表达逐渐增强(Rh215、30及40 mg·L-1组PC-3M细胞GRIM-19与β-actin密度比值分别为: 1·19、1·27及1·51)。Rh2中、低剂量组与对照组比较,差异具有显著性(P<0·05); Rh2高剂量组与对照组比较,差异具有非常显著性(P<0·01),见图2。

　　2·3　GRIM-19蛋白表达水平分析　Western blotting分析可见在约16 600处出现GRIM-19的条带,见图3。随着Rh2浓度的增加GRIM-19蛋白表达较对照组逐渐增强(Rh215、30及

　　40 mg·L-1组, GRIM-19蛋白密度吸光值分别为: 1·37、1·49及1·76)。Rh2中、低剂量组与对照组比较,差异具有显著性(P<0·05), Rh2高剂量组与对照组比较,差异具有非常显著

　　性(P<0·01)。

　　3　讨　论

　　人参为五加科多年生草本植物,现代医学研究表明,人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用[2]。但人参总皂苷成分较复杂且作用各不相同,甚至作用截然相反。人参单体皂苷Rh2生物作用专一,具有较强的抗癌活性,无明显的毒副作用,是理想的抗肿瘤药物,其潜在的抑癌作用已经引起亚洲许多国家科研部门的重视。

　　细胞凋亡是由于内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起的细胞主动死亡过程,这一过程对消除机体内老化细胞及具有潜在性异常生长的细胞,以及保持机体处于稳态起着重要的作用[3]。本室曾发现Rh2对激素非依赖性人前列腺癌细胞PC-3M有增殖抑制作用,并能显著增强顺铂(DDP)的致凋亡作用[4]。MTT结果显示:Rh2抑制PC-3M细胞的生长并呈剂量依赖性;流式细胞术结果表明: Rh2作用于PC-3M细胞, S、G2+M期细胞数减少, G1期细胞数增多,出现明显的G1期阻滞现象。因此,可以认为Rh2的抗肿瘤作用之一是诱导细胞凋亡。有文献报道, Rh2可通过降低PKC活性、降低c-myc表达、产生ROS(活性氧簇)、激活caspases等多种途径诱导细胞凋亡[5]。许多引发凋亡的刺激通过源于细胞表面的死亡受体/配体的外源性途径和来自线粒体释放细胞色素C的内源性途径激活caspases。Finucane

　　等[6]研究发现Bax异位表达诱导凋亡时伴有细胞色素C的早期释放和caspase的激活。同时,激活的caspases诱导内源性死亡信号通路开放,细胞色素C由线粒体释放,随后凋亡活化因子1(APAF-1)、caspase-9形成凋亡体导致下游caspases效应器caspase-3和caspase-7活化。GRIM-19基因是GRIMs新家族成员之一,2000年由Angell等[7]应用反义基因敲除的方法分

　　离发现,其过度表达可增加IFN/RA诱导的乳腺癌细胞凋亡率。GRIM-19为一小核蛋白,定位于人染色体19p13·1,是线粒体复合体I组成成分,主要位于线粒体内膜上。本文作者重点观察了Rh2诱导PC-3M细胞凋亡过程中GRIM-19基因和蛋白的变化。RT-PCR结果显示,随着Rh2浓度的增加, GRIM-19 mRNA表达逐渐增强,与对照组比较,差异具有显著性(P<0·05, P<0·01)。同样, GRIM-19蛋白表达与RT-PCR结果一致,呈成功表达。收集转染细胞, RT-PCR结果显示hERβ的表达明显增加。本实验成功构建了hERβ的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。为进一步研究ERβ在激素非依赖性前列腺癌发病中的作用及其调节途径对前列腺癌细胞的影响奠定了实验基础。