肿瘤细胞端粒、端粒酶调节机制研究进展与临床意义 加

导读：肿瘤细胞端粒、端粒酶调节机制研究进展与临床意义 加

关键词：端粒；端粒酶；肿瘤；细胞周期；凋亡

　　摘要：随着对端粒、端粒酶结构、功能、调控及其与细胞增殖、分化、凋亡及癌变的关系的深入研究，人们对端粒、端粒酶在细胞永生化及癌变过程中的作用较前了一更新的认识。端粒酶对恶性肿瘤的诊断、预后估计及针对端粒酶有效成分的反义核酶在肿瘤的基因治疗中具有重要的临床意义。

　　端粒（telomere）是染色体末端由DNA与调节蛋白组成的特殊复合体，具有防止染色体末端降解、融合而起到保护染色体完整性、维持细胞稳定性的作用。端粒酶（telomerase）则是一种核糖蛋白体酶，能利用自身RNA为模板合成端粒DNA，弥补随着细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒长度。增殖盱盛的胚胎细胞、活化的白细胞及85%的肿瘤细胞具有端粒酶活性。随着胚胎细胞分化成熟，端粒酶活性逐渐降低直到无法测出。正常细胞端粒酶可引起生长的停滞或细胞死亡，而增加生化及癌变中起到一定作用，因而在肿瘤的诊断治疗中具有重要的临床意义。

　　1、端粒、端粒酶的结构和功能

　　1.1在脊椎动物端粒的DNA结构为5‘(TTAGGG)n-3‘重复序列，调节蛋白（Telomerase Regulatory Factors,TRF1、TRF2），二者C-末端都有特异性的Myb重复序列同源保守域（telobox），可特异性识别并结合端粒的双链DNA及3‘端富G的单链尾。中间部分都有长约200核苷酸的同源二聚体化域。所不同的是TRF1的N-末端是酸性基因，而TRF2的N-G末端是碱性基因。野生型TRF1过表达可导致端粒进行性缩短，而突变型（缺失DNA-结合域）TRF1可延长端粒，表明它调节端粒酶依赖的端粒长度。TRF1蛋白结合于端粒重复序列上数量可作为负性的长度依赖性的调节因子。突变（显性失活）TRF2过表达的细胞表现为端粒缩短，结合于双链DNA的TRF2减少，未端单链G尾丢失，引发由P53介导的损伤途径，染色体出现端端融合、有丝分裂的发生率异常升高甚至直接导致细胞凋亡。提示TRF2的作用在于调节端粒的功能。它通过维持端粒功能性单链3‘-G尾的稳定而直到防止其端端融合而保护染色体及细胞的完整性。

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然而该模式无法解释为何结合双链DNA上的TRF2蛋白影响到单链G尾的稳定性及何染色体末端单链G尾不被当作DNA损伤问题。Griffith等结合电镜观察提出端粒结构假说——D-loop-T-loop。由于TRF2的存在，DNA双链形成“环状（T-loop）”，而单链G尾的TTAAGGG在环的端口内侧与CCCTAA碱基互补形成100-200碱基对D-loop，由此保护了DNA末端不受损坏，而TRF2蛋白很可能结合于D-loop接口处参与了T-loop-D-loop的形成与稳定。T不结构模式亦直接或间接地参与染色体末端结构稳定性的维持。TRF2对端粒结构的稳定可能提示了端粒酶的其他作用；随着DNA复制，端粒逐渐缩短，TRF2结合位点逐渐减少至消失，端粒失去了TRF2的保护作用。端粒酶通过在端粒末端合成TTAGGG重复片段而提供TRF2结合位点，使TRF2蛋白结合于其上行使防止染色体融合的功能。

1.2端粒酶RNA（Telomerase RNA Component,TR）和端粒酶逆转录酶（Telomerase Reverse Traciptase，TERT）是端粒酶发挥作用的核心组分。

1.2.1TR

hTR模板区包含与人端粒序列互补的11核苷酸（5‘CUAACCCUAAC-3‘）。端粒酶活性增高的生殖细胞及肿瘤细胞表达大量hTR，增加端粒酶阴性细胞内hTR的表达可激活端粒酶。向肿瘤细胞导入hTR的反义链显示出端粒酶活性受抑，端粒进行性缩短，大部分细胞增殖停止或凋亡。故hTR是端粒酶发挥作用所必须的。这便是Blasco等用基因敲除（knockout）技术建立mTR获得端粒酶阴性小鼠并进行系列相关研究的基础。尽管肿瘤细胞中hTR水平明显高于相应癌旁组织，但它与端粒酶活性仅呈微弱的平行关系，与肿瘤的部位、大小、分化程度、病理类型等无关。有些无端粒酶活性的正常体细胞（如肾脏、前列腺、肝脏等）亦表达hTR，表明这些组织中hTR 是无活性。提示hTR不宜作为反映临床肿瘤恋和预后的良好指标。

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1.2.2TERT

hTERT在端粒酶阳性的原发肿瘤组织中高表达，而端粒酶阴性细胞株不表达。Kyo等的研究表明在肿瘤细胞中hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性呈正相关。在端粒酶阴性的复制衰老前体(pre-senescent)细胞中异位表达hTERT将导致端粒酶活化、端粒延长，细胞绕过复制衰老而获永生。并且，hTERT与ras、c-myc癌基因共同转染可使正常人细胞转化为癌细胞。Hahn等建立了无催活性的dominent negative-hTERT(DN-hTERT)并将之转入卵巢癌、直肠癌、乳腺癌及肾胚胎细胞癌等细胞系中，发现端粒酶活性受到抑制，端粒酶逐渐缩短，细胞增殖停止。当端粒缩短至极限时，细胞发现典型的非P53介迅捷凋亡。而在不依赖端粒酶活性维持端粒长度的永生化幼儿细胞系GM847中，DN-hTERT未能引起上述相应变化。细胞原始端粒升高越短，其增殖停止及凋亡出现越早。因而，DN-hTERT通过端粒升高的缩短，而非DN-hTERT本身导致肿瘤细胞增殖受体乃至凋亡。上述研究表明，hTERT是端粒酶活性及端粒长度维持在细胞永生化及恶性转化中起决定作用的成分，而端粒酶抑制剂可快速有效地诱导具有短端粒长度的肿瘤细胞凋亡。

2、端粒、端粒酶与细胞增殖、分化、癌变及凋亡

端粒酶活化与细胞周期调控密切相关。当细胞终末分化受可逆性抑制而退出细胞周期时端粒酶活性下调，且分化程度与酶活性呈反向关系；返之，端粒酶被激活，且S期端粒酶活性高于G1及G2/M期。在一些肿瘤细胞系，因培养条件的不同，端粒酶活性随细胞的不同生长状态受到双向调节。人乳腺癌中变发现，端粒酶的高活性水平伴有周围蛋白cyclin D或cyclin E的高表达，推测某些周期蛋白参与端粒酶活性的调控。某些诱导分化剂对实体瘤细胞在癌变过程中活化的端粒酶无影响，但可下调造血系统及胚胎细胞来源的恶性肿瘤的端粒酶活性，推测它们很可能通过激活某种酶活性抑制途径而非直接抑制端粒酶的活性。

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各种原因导致的癌基因活化或抑癌基因突变使正常细胞绕过衰老，继续复制。随着端粒的不断缩短，细胞的遗传性状更加不稳定而引起广泛凋亡。仅有少数细胞由于重获端粒酶活性或通过重组（recombination）等其它途径（alternative lengthening of telomeres,ALT）使端粒长度得以维持，越过复制极限（crisis）面无限复制下去成为永生化或恶性转化细胞。因而，癌细胞的形成必需战胜复制衰老及极限。而端粒酶活性升高或INK4a者交配后产生的mTR-/-INK4a-/-小鼠繁殖几代后，端粒升高明显缩短，肿瘤发生率较单纯INK4a-/-者降低50%以上；而重复表达mTR后则恢复与INK4a-/-者相似的致癌潜能。进一步证实INK4a-/-及端粒作用的完整性是细胞癌变所必需的。

然而Rudolph等发现，尽管mTR-/-前几代小鼠与mTR-/-小鼠相比仍然保持健康，但mTR-/-第6代及以后小鼠则显示出不育、脾细胞及骨髓细胞增殖能力下神经管畸形等引发的死胎率上升、寿命缩短、对应激反应能力下降和肿瘤发生率升高等，提示端粒酶活性及端粒长度的维持对衰老组织健康的维持作用。癌变率升高可能是由于端粒的破坏失去了染色体的保护作用引发遗传不稳定性而致癌。年龄依赖的端粒缩短是肿瘤细胞绕过复制衰老的危险因素。这个理论似以传统的“端粒酶活性升高，端粒长度维持是细胞恶性转化的关键”相悖。可能的解释是：分裂早期失端粒失功能可导致遗传不稳定而引发条件。因而，端粒酶可能在不同的遗传背景下分别行使促进或阻止肿瘤发生的两个相互矛盾的作用。

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并非所有的肿瘤都表达的端粒酶活性，有些类型或阶段的肿瘤不表达之。实验显示mTR-/-小鼠与mTR-/-小鼠细胞在转染癌基因或抑癌基因失活后均能癌变，提示端粒酶与细胞癌变发生与否无在。也许，在细胞癌变过程中，端粒酶既非“油门”又非“刹车”，而是“油箱”，汔油既不能使汽车开动及加速，又不能使它停下来。介孬汔油用尽时它只能停下来。在有端粒酶活性表达的情况下，只要有癌基因激活又无抑癌基因细胞会象正常的不表达酶活性的细胞一样，随着细胞分裂，端粒逐渐缩短，细胞衰老，最终通过凋亡而被机清除。故推测端粒酶对于肿瘤的维持，而非发生是必要的。当然，对于推测端粒酶对于肿瘤的维持，而非发生是必要的。当然，对于端粒酶与细胞癌变的确切关系，也许只有端粒酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用结果才是最有力的结论。

增殖及凋亡控异常均是肿瘤细胞与正常细胞的特征性区别，故端粒酶和凋亡很可能存在某种联系。Chin等以实验显示，mTR-/-P53-/-小鼠及mTR-/-P53+/+小鼠培养6代后出现不同结果；前者逃避了细胞周期检查点的监视而呈现细胞凋亡。另外，后者中有少数细胞可经某种机制绕过检查点而继续增殖避免了凋亡。这些未死细胞增殖到7、8代后端粒长度进一步缩短，功能更加减弱，细胞遗传状更不稳定，大部分细胞凋亡，而极少数由于重获端粒酶活性或ALT维持端粒长度，细胞得以永生化或恶性转化。上述结果提示，缺乏端粒酶活性的细胞当端粒酶短到一定程度时可激活P53，分别经历P53依赖性或非P53依赖性途径引发凋亡；因重获端粒酶活性或ALT后端粒长度得以维持则是DNA受损细胞逃避死亡的一种适应性现象，而那些缺乏适应能力的细胞因端粒过短，染色体交联、端端融合死亡。Kondotffu将反义hTR转入人神经胶质瘤细胞系后端粒酶活性受抑，40%细胞经复制30代后高表达caase蛋白并凋亡，其余细胞则高表达周期素领带性激酶抑制因子（cyclin dependent kinases inhibitor,CDKI）P27/P21使细胞逃避凋亡呈现分化特征。提示抑制肿瘤细胞端粒酶活性会导致两种结果：分别由caase及CDKI而抑制其调亡与分化。实验亦从反而证实端粒酶不仅维持肿瘤细胞的增殖，还通过抑制caase及CDKI而抑制其凋亡和分化。Mandal等以实验揭示，端粒酶活性受凋亡抑制基因bcl-2的调控作用；bcl-2的稳定高表达可上调其活性，反之亦然。大量实验表明多种细胞系中，端粒酶活性及端粒长度的维持是细胞抗凋亡所必须的。说明端粒酶活性变化受到凋亡信号转导调控分子的影响，或者说，端粒酶参与了凋亡的调控。空间是端粒酶破坏使染色体失端粒失保护作用而引发凋亡，还是细胞凋亡细胞核完整性破坏而影响端粒酶的表达，亦或 bcl-2下调或caase活化同时启动凋亡及酶活性下降两条相互独立的途径，尚待深入研究。

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3、端粒、端粒酶对恶性肿瘤诊断、治疗及预后的临床意义

不管在肿瘤细胞形成过程中，端粒酶激活是否是其始动因素，端粒酶已被证实确有促进肿瘤细胞增殖的作用，端粒酶活性升高在肿瘤细胞逃避复制衰老而逐渐形成的过程中作用重要，而且许多恶性肿瘤细胞的端粒酶活性远高于那些高度增殖的正常细胞的酶活性，故端粒酶活性仍不失为恶性肿瘤早期诊断、危险度分级及预后的较理想指标。15%以上的癌前病变可检测到端粒酶活性，提示这些看似正常的组织中已含有恶性细胞；在预后较差的Ⅲ、Ⅳ期儿童成神经细胞瘤中可检测到高水平的酶活性，而预后良好的Ⅳ-S期端粒酶呈阴性，提示端粒酶阳性的肿瘤预后较差；约50%的早期膀胱癌因缺乏有效的细胞学标志而失去早期诊断治疗的机会，而90%以上的该病端粒酶活性标记的良性前列腺增生与前列腺癌；超过10%的经活检被证明消除干净的癌旁标本中可检测到端粒酶活性，故它还可作为肿瘤残存或复发病灶的标志。临床端粒酶活性的（Telmere Repeat Amplification Protocol,TRAP aay）灵敏度高，均为端粒酶活性作为方便快捷准确诊断肿瘤的标记物在临床普及提供了基础。

近年来，“端粒、端粒酶假说”已被越来越多的研究所证实。以端粒酶活性水平为肿瘤诊断的生物标记和预后指标，以端粒酶及其调节蛋白为靶点挖掘新的抗肿瘤药物，如反义寡核苷酸、核酶、核苷类似物蛋白激酶抑制剂、细胞分化诱导剂等越来越受人们的关注。研究表明，酶抑制不但可以直接抑制肿瘤细胞生长，还可提高肿瘤细胞对破坏DNA抗癌药的敏感性及对凋亡的感受体，与手术及药物治疗肿瘤有协同作用，且对表达端粒酶活性的政党细胞无明显副作用。然而，端粒酶抑制是否会诱发非酶依赖的端粒延长途径而维持肿瘤细胞的生长？肿瘤？如果不是，二者联用可否提高疗效，减少毒副作用？这些问题仍有待进一步研究。

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文章为中药网