中医疗法用人参皂甙治疗白血病取得进展

凌昌全　俞超芹　潘瑞萍　黄雪强　张登海

凌昌全　俞超芹　潘瑞萍　黄雪强

(中国人民解放军第二军医大学长海医院中医科,上海市长海路　200433)；

张登海

(中国人民解放军第二军医大学长征医院)

关键词：白血病；淋巴细胞；急性；中医药疗法；人参皂甙；药理学；肿瘤细胞；培养的；药物作用

摘　要：本研究应用DNA断裂点标记法(TUNEL)、DNA凝胶电泳、光镜及RT-PCR等技术探讨人参皂甙对人T淋巴细胞白血病细胞株(6T-CEM)凋亡基因的影响。结果：放线菌酮、放线菌素D本身可诱导6T-CEM细胞凋亡；人参皂甙+放线菌酮、人参皂甙+放线菌素D两组的凋亡率与放线菌酮、放线菌素D组差异无显著性。人参皂甙可使6T-CEM细胞Bc1-2、bax基因表达显著降低，其中Bc1-2降低尤为明显。提示放线菌酮或放线菌素D通过抑制某些抗凋亡蛋白的合成而诱导6T-CEM细胞凋亡。人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡的机理是通过抑制bc1-2基因表达、降低bc1-2/bax比率，从而诱导细胞凋亡。

近年来的研究发现，人参皂甙可预防和治疗肿瘤，如人参皂甙对急性非淋巴细胞白血病细胞及对单核样白血病系U-937细胞有诱导分化作用^［1～3］，可使肝癌细胞系SMMC-7721细胞由G₁/G₀期进入S期，同时阻止S期细胞进G₂/M期，抑制细胞增殖^［4］。我们以往的实验结果表明，人参皂甙可显著抑制人急性白血病T淋巴细胞株6T-CEM细胞的增殖，诱导6T-CEM细胞凋亡，并有明显的时间和剂量效应。本研究通过观察放线菌素D和放线菌酮对人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡的影响及人参皂甙对6T-CEM细胞凋亡基因表达的影响，进一步探讨人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡的机理。

1.1　材料：6T-CEM(中国科学院上海分院细胞所)用含10%的小牛血清的RPMI-1640(GBICO)安全培养液培养。人参皂甙(第二军医大学药学院提供)；DNA断裂点标记(TUNEL)标记液、Streptavidin-AP、碱性磷酸酶底物(NBT/BCIP,德国宝灵曼公司)；放线菌素D和放线菌酮(华美公司)；总RNA抽提试剂盒(华顺公司)；AMV反转灵试剂盒(Promega)；TaG DNA聚合酶(华美公司)；PCR仪(PE，2400)；扩增相关基因引物(中国科学院上海分院生化所合成)。
　　1.2　方法
　　1.2.1　放线菌酮和放线菌素D对人参皂甙细胞毒性影响：6T-CEM细胞调整为1×10⁶/ml，将细胞分成6组：(1)空白对照组；(2)5μg/ml放线菌酮组；(3)0.125μg/ml放线菌素D组；(4)50μg/ml人参皂甙组；(5)人参皂甙+放线菌酮组；(6)人参皂甙+放线菌素D组。培养15小时后，计数台盼兰染色阳性死亡细胞。
　　1.2.2　放线菌素D和放线菌酮对人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡影响：(1)调整6T-CEM细胞浓度为1×10⁶/ml，接种在进口24孔板中。(2)将细胞分成6组，方法同毒性实验。(3)37℃二氧化碳孵箱内继续培养15小时，收集细胞悬液，离心，去上清，加入40%甲醛，固定15分钟，离心，PBS洗涤。(4)加穿透液(含0.1%TritonX-100、0.1%NaAc)，PBS洗涤。(5)在显微镜下点片，凉干。(6)TUNEL标记液作用60分钟，37℃水浴。(7)PBS洗涤，TUNEL Buffer 1洗涤背景。(8)加Streptavidin-AP置37℃水浴30分钟。(9)NBT/BCIP显微镜下显色。(10)核固红复染。(11)自然干燥后中性树胶封片。显微镜下计数阳性细胞。细胞核染成蓝色为阳性细胞。
　　1.2.3　人参皂甙对凋亡相关基因的影响：(1)6T-CEM细胞调整为1×10⁷/ml，分别与50μg/ml人参皂甙、0.2μg/ml羟基喜树碱共育15小时，收集细胞。mRNA抽提、mRNA反转录分别按试剂盒说明操作，PCR扩增按常规方法进行。(2)取PCR产物20μl，2%琼脂糖凝胶电泳，用密度扫描仪对特异性条带进行密度扫描，各基因扫描值用同一标本β-actin扫描值进行校对。
　　1.2.4　统计学处理：采用t检验。

2.1　放线菌酮和放线菌素D对人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡及细胞毒性影响：台盼兰染色结果显示，5μg/ml放线菌酮、50μg/ml人参皂甙对6T-CEM细胞毒性较小，其台盼兰染色阳性率与空白对照组无明显区别，但人参皂甙+放线菌酮对6T-CEM细胞毒性明显增加。5μg/ml放线菌酮、0.125μg/ml放线菌素D可显著诱导6T-CEM细胞凋亡。人参皂甙+放线菌酮、人参皂甙+放线菌素D两组的凋亡率与放线菌酮和放线菌素D组差异无显著性，见表1。

表1　放线菌酮和放线菌素D对人参皂甙诱导6T-CEM
细胞凋亡及细胞毒性的影响(±s)

分　　组	标本数	台盼兰阳性率(%)	细胞凋亡率(%)
空白对照组	3	6.94±0.68	10.73±1.25
人参皂甙组	3	7.32±0.5	17.04±2.35*
放线菌酮组	3	6.48±0.73	29.35±3.24*
放线菌素D组	3	10.20±1.86*	40.94±5.96*
人参皂甙+放线菌酮组	3	11.04±1.78*	30.22±2.55*
人参皂甙+放线菌D组	3	27.44±3.59*	42.53±5.67*

　　与空白对照组比较，*P＜0.05

2.2　TUNEL：显微镜下所见，细胞收缩变小，染成蓝色的为凋亡细胞(图略)。
　 2.3　人参皂甙、羟基喜树碱对6T-CEM细胞相关凋亡基因表达的影响：PCR产物电泳结果及对特异性条带密度扫描显示，人参皂甙能导致所有凋亡相关基因下降，其中bc1-2下降尤其明显。羟基喜树碱主要是bc1-2下降，并且伴有促凋亡基因ICE表达增加，见表2。

表2　6T-CEM细胞各种相关凋亡基因表达量相对比值(±s)

药物	标本数	bc1-2(%)	bax(%)	bc1-x1(%)	ICE(%)
人参皂甙	3	40.0±12.6	78.0±21.2	70.0±16.8	87.0±16.2
羟基喜树碱	3	61.0±9.0	46.0±12.0	123.0±47.0	168.0±33.0

　　注：正常对照组定为100%；计算公式(以人参皂甙bcl-2为例,其它基因相同)：(人参皂甙bc1-2密度值/人参皂甙β-actin密度值)/对照bc1-2密度值/对照β-actin密度值)×100%

　　细胞凋亡是一种主动的、由遗传控制的程序性现象，是主动自杀过程。正常情况下细胞增殖与细胞凋亡之间保持着一种动态平衡，这种平衡是维持多细胞生物自身稳定的重要因素。当细胞增值失控或细胞凋亡受阻都可导致肿瘤发生。已有研究表明,白血病发生机制之一是凋亡抑制基因表达增强或(和)凋亡活化基因受抑。放线菌酮或放线菌素D能抑制RNA的合成，作用于mRNA，干扰细胞的转录过程，阻止蛋白质的合成。已有研究表明,在细胞凋亡早期存在有新的大分子蛋白质的主动合成,此时用RNA和蛋白质抑止剂放线菌酮或放线菌素D可明显抑制凋亡^［5］。我们的实验结果显示，放线菌酮、放线菌素D本身可诱导6T-CEM细胞凋亡;人参皂甙+放线菌酮、人参皂甙+放线菌素D两组的凋亡率与放线菌酮、放线菌素D组无显著差异，并未因人参皂甙本身可诱导6T-CEM细胞凋亡而出现迭加。提示6T-CEM细胞存在抗凋亡蛋白的高表达，放线菌酮、放线菌素D通过抑制某些抗凋亡蛋白的表达而诱导6T-CEM的凋亡。人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡作用的机理可能与阻碍抗凋亡基因的表达有关。Bc1-2、bax和bc1-XL均属于bc1-2家族。Bc1-2定位于人染色体18q21.3，有3个外显子，编码一个含229个氨基酸的膜蛋白，具有抗凋亡作用；bax可与bc1-2形成异二聚体，bc1-2/bax比率是影响细胞凋亡的关键，如bc1-2表达高，则抑制细胞凋亡，反之，则促进细胞凋亡^［6，7］；bc1-XL起抑制细胞凋亡作用。ICE家族有6个成员，包括ICE、ICE_re1等，ICE家族高表达可引起细胞凋亡^［8］。已有许多证据表明，ICE家族是凋亡信号传导过程中的共同途经。6T-CEM细胞存在抗凋亡蛋白的高表达，放线菌酮或放线菌素D通过抑制某些抗凋亡蛋白的合成而诱导6T-CEM, , 细胞凋亡。人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡的机理是通过抑制bc1-2基因表达、降低bc1-2/bax比率，从而诱导细胞凋亡。羟基喜树碱除抑制抗凋亡基因bc1-2表达，还明显增加促凋亡基因ICE的表达。因此，人参皂甙诱导6T-CEM细胞凋亡的机理与羟基喜树碱不完全一致。这些研究结果为证实人参具有直接抗癌作用提供了部分有意义的实验依据。

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