S型与R型人参皂苷Rh2诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的体外研究

　　【摘要】目的  探讨人参皂苷Rh2(S型与R型)能够诱导人肺腺癌A549细胞凋亡。方法  采用MTT 实验测定细胞增殖能力;台肦蓝染色法检测细胞存活率;碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数;电镜观察细胞凋亡。结果  30μg/mL 的S型和R型人参皂苷Rh2 作用于A549 细胞48h 后，死亡率均明显高于正常组细胞(P <0.05);20(S)-Rh2 能阻滞细胞周期于G1 期，并且20(S)-Rh2 型的抗肿瘤活性明显强于20(R)-Rh2;电镜结果显示染色质浓集、断裂，核固缩并出现凋亡小体。结论  S 型和R 型人参皂苷Rh2 均具有促进A549 细胞凋亡的生物学功能。

　　【关键词】人参皂苷Rh2;人肺腺癌A549 细胞;细胞凋亡

　　人参皂苷抗肿瘤活性的研究已取得了很大的发展。体内及体外抗肿瘤研究表明，具肿瘤细胞毒活性的人参皂苷多为一些人参次苷及苷元，人参次苷及苷元的抗肿瘤临床价值已引起人们高度重视。人参皂苷R h 2 (Ginsenoside - R h 2 ，G-Rh2 或Rh2 )有C20 位立体构型即S 型和R型(图1)，20(S)-人参皂苷Rh2具有非器官特异性的广谱抗肿瘤作用，由于不同的肿瘤细胞具有不同的遗传背景，人参皂苷R h 2 对不同的肿瘤细胞通过不同机制发挥作用。本组在前期研究工作中发现2 0(R)- Rh2和20(S )- R h2作用48h对肿瘤细胞株A 5 4 9 的I C5 0 值分别为3 3 . 4 μg / m L 和2 8 . 5 μg / m L ，说明人参皂苷R h 2 具有抑制A 5 4 9 细胞增殖的作用，并且该抑制作用呈剂量依赖性，进一步的研究发现G-Rh2 具有引发G1期阻滞而抑制人肺腺癌A549 细胞增殖及诱导凋亡的作用，且G-Rh2诱导A549细胞凋亡作用可能与激活NF-κB信号通路相关。

　　在不断地研究中我们发现，人参皂苷Rh2对A549 细胞的作用不仅表现于阻滞增殖作用，对细胞凋亡也具有影响，本实验对人参皂苷Rh2对A549细胞凋亡的影响进行实验研究。

　　1 材料与方法

　　1.1  主要材料

　　20(S )-人参皂苷Rh 2，即20(S)-原人参二醇- 3 - O -β- D-吡喃葡萄糖苷和2 0 (R )- 人参皂苷R h 2，即2 0(R )- 原人参二醇- 3 - O - β- D -吡喃葡萄糖苷购自中国药品生物制品检定所。A 5 4 9 细胞购自中国协和医科大学基础医学细胞中心。优质胎牛血清(Hy clone ，美国)、D M E M 干粉(Gibco，美国)、0.2 5 % 胰酶- 0.0 2 % EDTA(吉诺生物医药技术有限公司)、噻唑蓝(MTT)、细胞周期试剂盒。

　　1.2 方法

　　1.2.1细胞常规培养

　　A549细胞培养于含10% 胎牛血清、1 % 青霉素和链霉素的DMED培养基中，培养条件为3 7 ℃，5 % CO2 。用0.25% 胰酶-0.02 %EDTA消化，传代，取增殖旺盛、状态良好的细胞用于实验研究。

　　1.2.2  台肦蓝染色法检测细胞存活率

　　A549细胞接种于6 孔培养板中，每孔2 m L 。常规培养至7 5 % ~ 8 0 %融合，换不含血清的新鲜D M E M 培养液，使细胞同步化。Rh2作用相应时间后用倒置显微镜观察细胞形态变化，每板加入0.4% 台肦蓝染色，计算死亡率及存活率。

　　1.2.3  碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期

　　收集培养的细胞，悬浮于4℃预冷的200μL  PBS 中，缓慢加入预冷的纯乙醇600μL (7 0 %)，悬浮固定细胞,4℃过夜。检测前用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2 次。每一样本中加入100μL  RNase 37℃中孵育15 m i n 。再加入200μL 碘化丙啶，室温下避光5 min。利用流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数。

　　1.2.4 电镜观察细胞凋亡

　　离心收集Rh2作用后24h的细胞，固定包埋，超薄切片，染色，日立H - 7500型透射电子显微镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化，并拍照。

　　1.2.5 统计学分析

　　实验数据均用χ±s 表示，数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析。组间差异采用t 检验进行处理，P <0.05表示差异具有统计学意义。

　　2. 结果

　　2.1  台肦蓝染色实验

　　台盼蓝染色实验结果显示(图2)，30μg / m L 的20(R)- Rh2 和20(S)- R h 2 作用4 8 h 均可明显促进细胞死亡，说明人参皂苷R h 2 具有促进A549细胞死亡作用。

　　2.2 碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期

　　碘化丙啶(P I )单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数结果见表1，结果显示，20μg / m L 的20(S)- R h 2 作用2 4 h 可影响A 5 4 9 细胞周期各时相的分布，G0/ G1 期细胞比例(7 8 . 2 % )显著高于对照组(64.2  %)(P <0.05)，S期细胞比例(13.1%)显著低于对照组(24.3 %)(P <0.01)，G2/M 期细胞比例(8.7%)与对照组(11.5%)比较无显著性差异(P>0 . 0 5 )。而2 0 μg / m L 的20(R)- R h 2 组A 5 4 9 细胞G0/G1 期细胞比例67% ，S 期细胞比例22.6% ，G2/ M期细胞比例10.4%，均与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。比较C-20位各异构体的抗肿瘤活性，可以看出，20(S)-Rh2能阻滞细胞周期于G1期，并且20(S)-Rh2型的抗肿瘤活性明显强于20(R)-Rh2。见表1。

　　2.3 透射电镜观察人参皂苷Rh2诱导A549细胞凋亡的超微结构变化

　　透射电镜下观察到(图3)对照组A549细胞体积较大，核膜完整、核仁清楚、染色质丰富，核浆比例大。而3 0 μg / m L 浓度的人参皂苷R h 2 处理A549细胞后，随着R h 2 作用时间的延长，A549细胞中逐步出现增多的凋亡细胞，作用24h 凋亡细胞表现出典型的超微结构特征。细胞表面微绒毛结构明显减少，细胞质电子密度增高，染色质浓集，核固缩、核分裂等形态学改变，并可见凋亡小体。20(S)- Rh2组细胞表面可见多出球形膨出，且有脱落，胞质细胞器减少，空泡

　　3 讨论

　　肿瘤的产生是丧失细胞功能调控的结果。生长信号的异常和细胞周期调控的异常将导致细胞增殖的异常，最终产生恶性克隆。研究进展表明：肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。因此，可以说肿瘤是细胞失控性生长所致的一类细胞周期性疾病。细胞周期调控的信号转导途径及其反馈环路上的一系列调节基因组成复杂的网络精确地调控细胞周期。肿瘤细胞的特征之一是异常增殖，抑制肿瘤细胞的增殖是治疗肿瘤的途径之一，也是抗肿瘤药物的基本要求。

　　人参次苷及苷元的抗肿瘤临床价值已引起人们高度重视。到目前为止，已发现的具有肿瘤细胞毒活性的人参皂苷均为人参次苷和苷元，并且抗肿瘤活性与化合物结构存在很大的关系。在抗肿瘤方面，20(S)- 人参皂苷Rh2、化合物CK和20(S)- 原人参二醇等人参次苷及苷元表现出明显的构效关系，它们在抗肿瘤方面的临床价值在国内外已引起高度重视。

　　G - R h 2 有C20位立体构型(S / R )，20(S)- 人参皂苷R h 2 具有非器官特异性的广谱抗肿瘤作用。本研究表明，20(S)- 人参皂苷Rh2的抗肿瘤作用与阻滞细胞周期有关，而20(S)- 人参皂苷R h 2 的抗肿瘤作用并不明显。

　　本实验研究结果证实人参活性成分对人肺腺癌A549细胞毒活性明显存在构效关系，G - Rh2 的C20位立体构型(S)，具有引发G1 期阻滞而抑制人肺腺癌A549细胞增殖及诱导凋亡的作用。30µg/mL S型和R型人参皂苷Rh2作用24 h 后，定量分析结果表明，S 型和R 型人参皂苷Rh2组无论是早期还是晚期凋亡率均明显高于正常组细胞，并且2 0 (S)-Rh2 组早期凋亡率明显高于20(R)- Rh2 组，表现出明显的构效效应，另外S 型和R 型的人参皂苷Rh2 诱导的A549细胞核形态呈现典型凋亡特征。不同构型的人参皂苷Rh2 究竟通过何种细胞信号转导通路干预肿瘤细胞增殖和凋亡?这些研究国内外均未见报道。我们下一步研究重点将在此方面展开以对人参活性成分抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的细胞与分子调控机理进行探讨，为进一步从细胞分子生物学水平上探索肿瘤治疗方法提供重要的科学依据和研究探索新方向。