20(S)-人参皂苷Rh2对人结直肠癌Caco-2和HT-29细胞增殖的影响

　　李秋影1, 2，颜璐璐2，张莉华2，张兰兰2，马晓慧2，郭治昕2 *

　　(1. 天津中医药大学，天津，300193;2. 天津天士力研究院药理毒理所，天津，300410)

　　摘 要：目的 本实验探讨20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和HT-29 细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用荧光微孔法测定20(S)-人参皂苷Rh2 对体外培养的人结直肠癌Caco-2、HT-29 细胞增殖的影响，并计算抑制率;利用显微镜观察给药后细胞形态变化。结果 20(S)-人参皂苷Rh2 对Caco-2、HT-29 细胞生长有抑制作用，并呈剂量依赖性;20(S)-人参皂苷Rh2 作用48h 后HT-29、 Caco-2 细胞达到半数抑制浓度(IC50)为20.66、27.18ug·mL-1;显微镜显示HT-29 细胞经25ug/ml 20(S)-人参皂苷Rh2 作用后细胞之间互相脱离，成多边形状，细胞破碎。

　　结论 20(S)-人参皂苷Rh2 可以抑制Caco-2、HT-29 细胞生长并导致其凋亡。

　　关键词：20(S)-人参皂苷Rh2;HT-29;Caco-2;细胞凋亡

　　Effect of 20(S)-ginsenoside Rh2 on the proliferation of human colon cancer cells Caco-2 and HT-29 LI Qiu-ying1, YAN Lu-lu2, ZHANG Li-hua2, ZHANG Lan-lan2, Ma Xiao-hui2, GUO

　　Zhi-xin2 *

　　(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193,China;

　　2：The Department of Pharmaclogy and Toxicology of Tasly，Tianjin，300410)

　　Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of 20(s)-ginsenoside-Rh2 on the proliferation of human colon cancer cell lines Caco-2 and HT-29。METHODS Cellgrowth inhibition was evaluated by Cell based Fluorescent Staining Digital Image High Content Screening assay. Cellular morphology was observed under Microscopy.

　　RESULTS 20(s)-ginsenoside Rh2 inhibited the proliferation of Caco-2、HT-29 cells in a dose-dependent manner. The IC50 of 20.66、27.18ug·mL-1 were detected after Caco-2、HT-29 cells treated with 20 (s)-ginsenoside-Rh2 for 48 hour; Microscopy showed obviously apoptosis morphologic changes of HT-29 and Caco-2 cells were treated with different 20(s)-ginsenoside-Rh2. CONCLUSION 20(s)-ginsenoside Rh2 exhibits the growth inhibition effects and induces apoptosis in the test concentration on human colon cancer Caco-2 and HT-29 cells.

　　Key words: 20(S)-ginsenoside Rh2; HT-29; Caco-2; Apoptosis

　　人参为五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A. meyer)的干燥根，是已有近几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明，人参包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性[1-4]。人参皂苷作为人参中一类主要药效成分，在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性，其中以人参皂苷R-Rg3 为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市[5]。

　　大量研究报道，人参皂苷-Rh2 也同样具有较好的抗癌活性[6-11],如诱导黑色素瘤细胞分化、逆转耐药的白血病细胞、通过细胞内caspase 一类半胱氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2 细胞的增殖并产生凋亡;药代动力学表明人参皂甙-Rh2 主要在肝、胃肠道分布[12]。目前研究已表明人参皂苷-Rh2 可以通过线粒体途径包括P53、CASP5 等多靶点诱导结肠癌SW480 细胞凋亡[13]。

　　从结构上，人参皂甙-Rh2 可分为S 型和R 型的构象，其中S-Rh2 是植物中分离的主要构型[14]。S 型的人参皂甙-Rh2(20(S)-G-Rh2)对人结直肠癌细胞的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20(S)-G-Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和HT-29 细胞增殖和凋亡的影响，以期为其的新药研发和临床治疗结直肠癌提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂及仪器

　　20(S)-G-Rh2(纯度为90%)由天津天士力药物研究院现代中药研究所提供;DMEM 培养基和胎牛血清购于GIBCO-BRL 公司;CMSEE、二乙酸荧光素(Fluorescein Diacetate, FDA)购于Sigma 公司;Caco-2、HT-29 细胞从协和医科大学基础医学细胞中心引进，由本实验室传代培养;Olympus 显微镜;Leica DMI6000 B 电动倒置荧光相差显微镜为莱卡公司产品。

　　1.2 细胞培养与传代

　　将HT-29 和Caco-2 细胞置于37 ℃，饱和湿度5%CO2 培养箱中常规培养，培养均用含10%热灭活胎牛血清，1%的抗生素(青霉素100mg·L-1 和链霉素100mg·L-1)的DMEM 完全培养基。细胞呈单层生长，达80%左右融合时，采用0.25%的胰酶和0.02% EDTA(1：1)混合消化液消化传代，取生长对数期的细胞用于实验。

　　1.3 荧光微孔法监测细胞增殖实验

　　将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞，用0.25%的胰酶和0.02% EDTA 混合消化液消化， 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 个·mL-1。接种于96 孔培养板中，每孔接种100 μL，于37℃，饱和湿度5%CO2 培养箱中培养24h 后换液，空白对照组不加药，实验组每孔加入20(S)-G-Rh2，浓度依次为50，37.5，25，18.25，12.5，9.125mg·mL-1 处理48h，每个浓度组及对照组均做3 个平行孔。吸弃板中培养基，加入100μL 含2.5μg·mL-1二乙酸荧光素的PBS，避光15min，甩去荧光染料，加入150μL 过滤的PBS 重复洗3 遍，甩去PBS 并吸弃板中剩余的PBS，Leica DMI 6000 B 电动倒置荧光相差显微镜在激发和发射波长分别为488 nm 和530 nm 下，测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，并求算出半数抑制浓度(IC50)。

　　细胞生长抑制率%=(1-给药组荧光强度/对照组荧光强度)×100%

　　1.4 显微镜观察细胞形态学变化

　　将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞，用0.25%的胰酶和0.02% EDTA 混合消化液消化， 用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL，每孔2 ml 细胞悬液种于6 孔板中放置盖玻片，培养细胞爬片生长。培养24 h，待细胞在盖玻片上贴壁良好后，加入1 ml 不同浓度20(S)-G-Rh2 (12.5、18.75、25μg·mL-1)处理细胞48h，在倒置显微镜下观察细胞核形态变化并记录。

　　1.5 统计学处理

　　用SPSS10.0 软件完成统计学处理，实验数据以均数±标准差即(x±s)表示，组间分析比较采用t 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 20(S)-G-Rh2 对Caco-2 和HT-29 细胞增殖的影响

　　FDA 可进入活细胞脱脂释放荧光素显荧光，激发和发射波长分别为488 nm和530 nm，常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA 为荧光指示剂建立了微孔板法进行20(S)-G-Rh2 对结肠癌细胞Caco-2 和HT-29 的增殖影响研究。结果显示，20(S)-G-Rh2 对Caco-2 和HT-29 细胞增殖具有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度而增强，呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29 和Caco-2 细胞细胞的半数抑制率(IC50)分别为20.7μg·m L-1 和27.2μg·m L -1。(结果如表1，图1)。

　　表1 不同浓度20(S)-G-Rh2 对Caco-2、HT-29 细胞的生长抑制率(x±s,n=3)

　　Tab.1 Growth suppression rate of Caco-2 after different concentration of 20(s)- G-Rh2(x±s,n=3)

　　Group 20(S)-G-Rh2/μg· m L -1

　　18.75 25 37.5 50 75

　　Caco-2 0.27±0.03 0.47±0.03 0.63±0.05 0.92±0.04 0.97±0.03

　　HT-29 0.46±0.09 0.81±0.10 0.98±0.02 0.99±0.0005 0.99±0.0001

　　P<0.05,vs.0μg·mL-1

　　(A) (B) (C) (D)

　　图1 荧光微孔法监测细胞增殖。A：HT-29 细胞组;B：HT-29 细胞25ug/ml 20(S)-Rh2

　　给药组;C：Caco2 细胞组;D：Caco2 细胞25ug/ml 20(S)-Rh2 给药组。

　　2.2 显微镜观察细胞形态学变化

　　HT-29 细胞经25μg·mL-120(S)-G-Rh2 处理48 小时后，与空白对照组比较，细形态变化不明显。25μg·mL-1 20(S)-G-Rh2 处理48 h 后的HT-29 细胞较空白对照组细胞数目明显减少，高倍显微镜下可见空白对照组的细胞成群贴壁生长，细胞透亮，折光性好，核圆而大，细胞核形态正常，染色质分布均匀。而给药组细胞之间互相脱离，与周围细胞脱离，成多边形状，细胞破碎。高剂量组处理的细胞

　　细胞轮廓消失，核崩解(见图2)。

　　(A) (B)

　　图2 20(S)-G-Rh2 对HT-29 细胞形态学的影响。A：HT-29 细胞组;B：HT-29

　　细胞25ug/ml 20(S)-Rh2 给药组。

　　3 讨论

　　人参皂苷是人参的主要活性成分，在人参皂苷单体中人参皂苷-Rh2 具有抑瘤活性，并对正常组织毒性甚低[11]。体内外实验结果表明：通过对细胞周期的影响，诱导细胞凋亡，从而时间和剂量依赖性地抑制多种肿瘤细胞的增殖[15-19]。但20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌细胞Caco-2 和HT-29 的研究还未见报道，因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2 和HT-29 细胞，考察20(S)-G-Rh2 对人结肠癌细胞的抑制及凋亡作用。

　　本研究结果表明，20(S)-G-Rh2 可抑制人结直肠癌细胞Caco-2 和HT-29 细胞生长，且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性。

　　细胞凋亡是由基因控制的一种自主的有序的细胞死亡。显微镜下显示：当不同剂量的20(S)-G-Rh2 作用48h 后的人结肠癌细胞HT-29 出现凋亡细胞形态，而对照组处理的人结肠癌细胞HT-29 仅出现少数的凋亡细胞。

　　综上所述， 20(S)-G-Rh2 体外抑制人结肠癌Caco-2 和HT-29 细胞的增殖，可能与细胞周期阻滞有关，也很可能与诱导部分细胞发生凋亡有密切关系，将有待于进一步探讨。随着对人参皂苷药理作用及其机制的深入了解，人参皂苷将在临床防治肿瘤方面具有广泛的应用前景。

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