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20(S)-人参皂苷Rh2对人结直肠癌Caco-2和HT-29细胞增殖的影响

2014-08-04

抗癌健康网

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导读:目的 本实验探讨20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和HT-29 细胞增殖及凋亡的影响。

  李秋影1, 2,颜璐璐2,张莉华2,张兰兰2,马晓慧2,郭治昕2 *

  (1. 天津中医药大学,天津,300193;2. 天津天士力研究院药理毒理所,天津,300410)

  摘 要:目的 本实验探讨20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和HT-29 细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用荧光微孔法测定20(S)-人参皂苷Rh2 对体外培养的人结直肠癌Caco-2、HT-29 细胞增殖的影响,并计算抑制率;利用显微镜观察给药后细胞形态变化。结果 20(S)-人参皂苷Rh2 对Caco-2、HT-29 细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性;20(S)-人参皂苷Rh2 作用48h 后HT-29、 Caco-2 细胞达到半数抑制浓度(IC50)为20.66、27.18ug·mL-1;显微镜显示HT-29 细胞经25ug/ml 20(S)-人参皂苷Rh2 作用后细胞之间互相脱离,成多边形状,细胞破碎。

  结论 20(S)-人参皂苷Rh2 可以抑制Caco-2、HT-29 细胞生长并导致其凋亡。

  关键词:20(S)-人参皂苷Rh2;HT-29;Caco-2;细胞凋亡

  Effect of 20(S)-ginsenoside Rh2 on the proliferation of human colon cancer cells Caco-2 and HT-29 LI Qiu-ying1, YAN Lu-lu2, ZHANG Li-hua2, ZHANG Lan-lan2, Ma Xiao-hui2, GUO

  Zhi-xin2 *

  (1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193,China;

  2:The Department of Pharmaclogy and Toxicology of Tasly,Tianjin,300410)

  Abstract: OBJECTIVE To investigate the effects of 20(s)-ginsenoside-Rh2 on the proliferation of human colon cancer cell lines Caco-2 and HT-29。METHODS Cellgrowth inhibition was evaluated by Cell based Fluorescent Staining Digital Image High Content Screening assay. Cellular morphology was observed under Microscopy.

  RESULTS 20(s)-ginsenoside Rh2 inhibited the proliferation of Caco-2、HT-29 cells in a dose-dependent manner. The IC50 of 20.66、27.18ug·mL-1 were detected after Caco-2、HT-29 cells treated with 20 (s)-ginsenoside-Rh2 for 48 hour; Microscopy showed obviously apoptosis morphologic changes of HT-29 and Caco-2 cells were treated with different 20(s)-ginsenoside-Rh2. CONCLUSION 20(s)-ginsenoside Rh2 exhibits the growth inhibition effects and induces apoptosis in the test concentration on human colon cancer Caco-2 and HT-29 cells.

  Key words: 20(S)-ginsenoside Rh2; HT-29; Caco-2; Apoptosis

  人参为五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A. meyer)的干燥根,是已有近几千年应用历史的名贵中药。现代医学研究表明,人参包含有机酸、维生素、糖类、无机盐、固醇、寡肽、多糖、挥发油类和人参皂苷等多种成分,具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性[1-4]。人参皂苷作为人参中一类主要药效成分,在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性,其中以人参皂苷R-Rg3 为主要成分的抗癌新药参一胶囊已作为中药一类新药上市[5]。

  大量研究报道,人参皂苷-Rh2 也同样具有较好的抗癌活性[6-11],如诱导黑色素瘤细胞分化、逆转耐药的白血病细胞、通过细胞内caspase 一类半胱氨酸蛋白酶进行信号传导进而诱导人黑色素肿瘤细胞A375-S2 细胞的增殖并产生凋亡;药代动力学表明人参皂甙-Rh2 主要在肝、胃肠道分布[12]。目前研究已表明人参皂苷-Rh2 可以通过线粒体途径包括P53、CASP5 等多靶点诱导结肠癌SW480 细胞凋亡[13]。

  从结构上,人参皂甙-Rh2 可分为S 型和R 型的构象,其中S-Rh2 是植物中分离的主要构型[14]。S 型的人参皂甙-Rh2(20(S)-G-Rh2)对人结直肠癌细胞的影响目前还未见报道。本研究旨在观察20(S)-G-Rh2 对人结直肠癌Caco-2 和HT-29 细胞增殖和凋亡的影响,以期为其的新药研发和临床治疗结直肠癌提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 试剂及仪器

  20(S)-G-Rh2(纯度为90%)由天津天士力药物研究院现代中药研究所提供;DMEM 培养基和胎牛血清购于GIBCO-BRL 公司;CMSEE、二乙酸荧光素(Fluorescein Diacetate, FDA)购于Sigma 公司;Caco-2、HT-29 细胞从协和医科大学基础医学细胞中心引进,由本实验室传代培养;Olympus 显微镜;Leica DMI6000 B 电动倒置荧光相差显微镜为莱卡公司产品。

  1.2 细胞培养与传代

  将HT-29 和Caco-2 细胞置于37 ℃,饱和湿度5%CO2 培养箱中常规培养,培养均用含10%热灭活胎牛血清,1%的抗生素(青霉素100mg·L-1 和链霉素100mg·L-1)的DMEM 完全培养基。细胞呈单层生长,达80%左右融合时,采用0.25%的胰酶和0.02% EDTA(1:1)混合消化液消化传代,取生长对数期的细胞用于实验。

  1.3 荧光微孔法监测细胞增殖实验

  将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞,用0.25%的胰酶和0.02% EDTA 混合消化液消化, 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基配成单个细胞悬液,调整细胞浓度为5×104 个·mL-1。接种于96 孔培养板中,每孔接种100 μL,于37℃,饱和湿度5%CO2 培养箱中培养24h 后换液,空白对照组不加药,实验组每孔加入20(S)-G-Rh2,浓度依次为50,37.5,25,18.25,12.5,9.125mg·mL-1 处理48h,每个浓度组及对照组均做3 个平行孔。吸弃板中培养基,加入100μL 含2.5μg·mL-1二乙酸荧光素的PBS,避光15min,甩去荧光染料,加入150μL 过滤的PBS 重复洗3 遍,甩去PBS 并吸弃板中剩余的PBS,Leica DMI 6000 B 电动倒置荧光相差显微镜在激发和发射波长分别为488 nm 和530 nm 下,测定每孔的荧光强度。根据荧光强度计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率,并求算出半数抑制浓度(IC50)。

  细胞生长抑制率%=(1-给药组荧光强度/对照组荧光强度)×100%

  1.4 显微镜观察细胞形态学变化

  将对数生长期的HT-29、Caco-2 细胞,用0.25%的胰酶和0.02% EDTA 混合消化液消化, 用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基配成单个细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/mL,每孔2 ml 细胞悬液种于6 孔板中放置盖玻片,培养细胞爬片生长。培养24 h,待细胞在盖玻片上贴壁良好后,加入1 ml 不同浓度20(S)-G-Rh2 (12.5、18.75、25μg·mL-1)处理细胞48h,在倒置显微镜下观察细胞核形态变化并记录。

  1.5 统计学处理

  用SPSS10.0 软件完成统计学处理,实验数据以均数±标准差即(x±s)表示,组间分析比较采用t 检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 20(S)-G-Rh2 对Caco-2 和HT-29 细胞增殖的影响

  FDA 可进入活细胞脱脂释放荧光素显荧光,激发和发射波长分别为488 nm和530 nm,常用于检测细胞存活率。本研究采用FDA 为荧光指示剂建立了微孔板法进行20(S)-G-Rh2 对结肠癌细胞Caco-2 和HT-29 的增殖影响研究。结果显示,20(S)-G-Rh2 对Caco-2 和HT-29 细胞增殖具有明显的抑制作用,其抑制作用随药物浓度而增强,呈现较好的剂量依赖性。计算药物对HT-29 和Caco-2 细胞细胞的半数抑制率(IC50)分别为20.7μg·m L-1 和27.2μg·m L -1。(结果如表1,图1)。

  表1 不同浓度20(S)-G-Rh2 对Caco-2、HT-29 细胞的生长抑制率(x±s,n=3)

  Tab.1 Growth suppression rate of Caco-2 after different concentration of 20(s)- G-Rh2(x±s,n=3)

  Group 20(S)-G-Rh2/μg· m L -1

  18.75 25 37.5 50 75

  Caco-2 0.27±0.03 0.47±0.03 0.63±0.05 0.92±0.04 0.97±0.03

  HT-29 0.46±0.09 0.81±0.10 0.98±0.02 0.99±0.0005 0.99±0.0001

  P<0.05,vs.0μg·mL-1

  (A) (B) (C) (D)

  图1 荧光微孔法监测细胞增殖。A:HT-29 细胞组;B:HT-29 细胞25ug/ml 20(S)-Rh2

  给药组;C:Caco2 细胞组;D:Caco2 细胞25ug/ml 20(S)-Rh2 给药组。

  2.2 显微镜观察细胞形态学变化

  HT-29 细胞经25μg·mL-120(S)-G-Rh2 处理48 小时后,与空白对照组比较,细形态变化不明显。25μg·mL-1 20(S)-G-Rh2 处理48 h 后的HT-29 细胞较空白对照组细胞数目明显减少,高倍显微镜下可见空白对照组的细胞成群贴壁生长,细胞透亮,折光性好,核圆而大,细胞核形态正常,染色质分布均匀。而给药组细胞之间互相脱离,与周围细胞脱离,成多边形状,细胞破碎。高剂量组处理的细胞

  细胞轮廓消失,核崩解(见图2)。

  (A) (B)

  图2 20(S)-G-Rh2 对HT-29 细胞形态学的影响。A:HT-29 细胞组;B:HT-29

  细胞25ug/ml 20(S)-Rh2 给药组。

  3 讨论

  人参皂苷是人参的主要活性成分,在人参皂苷单体中人参皂苷-Rh2 具有抑瘤活性,并对正常组织毒性甚低[11]。体内外实验结果表明:通过对细胞周期的影响,诱导细胞凋亡,从而时间和剂量依赖性地抑制多种肿瘤细胞的增殖[15-19]。但20(S)-人参皂苷Rh2 对人结直肠癌细胞Caco-2 和HT-29 的研究还未见报道,因此本研究通过体外培养人结肠癌细胞Caco-2 和HT-29 细胞,考察20(S)-G-Rh2 对人结肠癌细胞的抑制及凋亡作用。

  本研究结果表明,20(S)-G-Rh2 可抑制人结直肠癌细胞Caco-2 和HT-29 细胞生长,且这一变化在实验范围内存在剂量依赖性。

  细胞凋亡是由基因控制的一种自主的有序的细胞死亡。显微镜下显示:当不同剂量的20(S)-G-Rh2 作用48h 后的人结肠癌细胞HT-29 出现凋亡细胞形态,而对照组处理的人结肠癌细胞HT-29 仅出现少数的凋亡细胞。

  综上所述, 20(S)-G-Rh2 体外抑制人结肠癌Caco-2 和HT-29 细胞的增殖,可能与细胞周期阻滞有关,也很可能与诱导部分细胞发生凋亡有密切关系,将有待于进一步探讨。随着对人参皂苷药理作用及其机制的深入了解,人参皂苷将在临床防治肿瘤方面具有广泛的应用前景。

  4 参考文献

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