人参皂苷单体Rh2抑制小鼠前胃癌系细胞增殖及其机制

　　人参皂苷单体Rh2 抑制小鼠前胃癌系细胞增殖及其机制

　　吴　歌,李　红,杨世杰

　　(吉林大学白求恩医学部药理学教研室,吉林长春　130021)

　　基金项目:吉林省科技厅资助项目(No 20040411)

　　作者简介:吴　歌(1978 - ) ,女,博士生,研究方向:肿瘤药理学, Tel:0431285619483;

　　杨世杰(1946 - ) ,男,教授,博士生导师,研究方向:心血

　　中国图书分类号: R2332; R 28411; R 329124; R 329125;R 329128; R 735120513

　　文献标识码:A　文章编号: 1001 - 1978 (2008) 01 - 0101 - 05

　　摘要:目的　探讨人参皂苷Rh2 ( G2Rh2 ) 对小鼠前胃癌系(MFC)细胞增殖的抑制作用及其机制。方法　分别对MFC正常细胞组和G2Rh2 (3、10、30 mg·L - 1 )组经MTT法检测MFC细胞活性;倒置显微镜和Hoechst 33258荧光染色观察凋亡细胞形态; AnnexinV2F ITC双染法分析G2Rh2 对细胞凋亡率的影响;分别对MFC正常细胞组、G2Rh2 (10 mg·L - 1 )处理不同时间( 30 min、1、2、4 h) 组、SP600125 ( 5 μmol·L - 1 )预处理2 h + G2Rh2 (10 mg·L - 1 )不同时间(30 min、1、2、4 h)给药组经MTT法检测MFC细胞活性;Western blot法检测G2Rh2 (10 mg·L - 1 )处理不同时间(5、15、30、45 min、1、2、4 h)组p2JNK( c2Jun N2terminal kinase 1)激酶和p2c2jun在MFC细胞中的活性,免疫细胞化学染色法检测caspase23阳性细胞的表达率。结果　G2Rh2 对无血清MFC细胞有明显细胞毒活性,呈时间和剂量依赖关系;能明显诱导细胞皱缩,核染色质固缩,核碎裂,形成大约为180～200 bp 或其多聚体组成的寡核苷酸片断,凋亡细胞比率上升。G2Rh2 处理后4 h内, p2JNK激酶和p2c2jun活性持续升高,此过程可被预处理2 h的SP600125 (5μmol·L - 1 )部分抑制。

　　结论　人参皂苷G2Rh2 可诱导MFC细胞凋亡,其作用机制之一可能是通过激活JNK信号传导途径,并最终增加caspase23的激活而完成。

　　关键词:人参皂苷Rh2 ;MFC细胞;凋亡; c2Jun N2terminal ki2 nase 1

　　人参皂苷单体Rh2 (G2Rh2 )是从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物,多国研究者已在一些肿瘤细胞体外培养系中[ 1 - 5 ]观察到其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,并初步揭示该过程与诱导细胞凋亡、分化及阻滞细胞周期等有关。而关于G2Rh2 对胃癌细胞增殖抑制及其相关分子机制的研究未见报道。本研究以小鼠前胃癌细胞株MFC为研究对象,观察不同浓度G2Rh2 诱导胃癌细胞凋亡的作用,并初步探讨相关的分子机制。

　　1　材料与方法

　　1. 1　试剂　G2Rh2 由吉林大学分析化学教研室提供,纯度大于99%; IMDM ( Iscove′sModified Dulbec2co′sMedium)购自美国Gibco公司; 新生小牛血清( FBS) 购自杭州四季青生物有限公司; Hoechst33258购自凯基生物科技发展有限公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物技术有限公司; Triton X2100 购自上海生工生物有限公司;牛血清白蛋白(BSA)购自美国Biosharp公司;二氨基联苯胺(DAB )显色剂购自福州迈新生物技术

　　开发公司; p2JNK、p2c2jun、caspase23 抗体购自cellsignaling Technology公司; SP600125 购自Sigma 公司。

　　1. 2　细胞来源及培养　小鼠前胃癌细胞系(MFC)细胞由本室冻存,经常规复苏后培养和维持在体积分数为011 FBS的IMDM培养液里,置CO2 培养箱(37℃, 5% CO2 )中培养,取对数生长期细胞经24 h无血清培养后,分组进行实验。

　　1. 3　分组及细胞处理　MFC细胞(密度为110 ×109 ·L - 1 )根据要求分为:空白组、G2Rh2 ( 3、10、30mg·L - 1 )组,检测114、115、116 各项实验指标;空白组、G2Rh2 (10 mg·L - 1 ) 不同时间(30 min、1、2、4h)给药处理组、SP600125 (5μmol·L - 1 )预处理2 h+ G2Rh2 (10 mg·L - 1 )不同时间( 30 min、1、2、4 h)给药处理组,检测114 实验指标; G2Rh2 ( 10 mg·L - 1 )不同时间(0、5、15、30、45 min、1、2、4 h)给药处理组,检测117 实验指标;空白组、G2Rh2 ( 10 mg·L - 1 )给药处理组、SP600125 (5μmol·L - 1 )预处理2 h + G2Rh2 (10 mg·L - 1 )给药处理组,检测118实验指标。

　　1. 4　MTT法检测细胞活性　收获各组细胞,每组6复孔,每孔190μl接种于96孔培养板内,分别经用无血清和体积分数为011的FBS中培养24 h后加入G2Rh2 ,继续培养1、2 h和4 h,培养结束前每孔加入10μlMTT(5 g·L - 1 ) ,待形成蓝紫色甲臜后,吸弃孔中上清液,加入100μl DMSO,充分振荡溶解结晶,用酶联免疫检测仪( Sunrise Remote,Australia)中国药理学通报　Chinese Pharm acological B ulletin　2008 Jan; 24 (1) : 101～5 ·101·于570 nm波长处测其吸光度A值,各重复3次独立实验。

　　1. 5 　细胞形态学变化　各组细胞于倒置显微镜200 ×视野下进行形态学改变的观察并照相;在同一视觉域内用Hoechst 33258 ( 10 mg·L - 1 )进行核染色,然后在荧光显微镜(Leica MicrosystemsWetzlarGmbH, Germany)下观察细胞核形态并记录。

　　1. 6　流式细胞仪分析早期细胞凋亡率　细胞收获后,用4℃预冷磷酸缓冲液( PBS)洗2次,用250μl结合缓冲液重悬细胞,调节其密度为1 ×109 ·L - 1 ,取100μl细胞悬液于5 ml流式管中,加入5μl An2nexin V2F ITC (150 mg·L - 1 )和10μl碘化丙锭(120mg·L - 1 ) ,混匀后室温避光孵育15 min,在反应管中加400μl PBS,流式细胞仪( FACS)分析细胞凋亡率。

   　　1. 7　Western blot测定MFC细胞中JNK( c2JunN2term ina l k ina se 1)激酶和c2jun激酶磷酸化含量　各组样品经考马斯亮蓝定量后进行SDS2PAGE电泳, 电泳结束后将蛋白样品转移至聚偏氟乙烯( PVDF)膜上, PVDF膜用3% BSA封闭后与适当稀释的一抗4℃孵育过夜,再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,DAB试剂盒显色, GIS天能紫外凝胶成像分析系统计算各条带的光密度值。

　　1. 8　免疫细胞化学法测定M FC细胞中ca spa se23的表达　收集细胞,将细胞涂布于预先用多聚赖氨酸包被的载玻片上, 4%多聚甲醛固定10 min,水化10 min,体积分数为0101 的Triton X2100 作用15min; 0101 mol·L - 1 PBS冲洗3次,每次5 min;以下按免疫组化试剂盒操作说明书进行;滴加DAB,室温避光显色15～20 s,水终止反应,苏木精染核, 1%盐酸乙醇分化,蒸馏水返蓝,梯度乙醇脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,光镜下(Olympus)观察结果并拍照。结果采用image2p rotein p lus统计软件进行处理,每张照片选择5个不重复染色阳性高密区,计算蛋白表达棕黄色阳性区域平均光密度( IOD /Area) ,组间差异采用t检验。

　　1. 9　统计学处理　结果采用表示.x ±s,组间比较采用t检验。

　　2　结果

　　2. 1　G2Rh2 对MFC 细胞活性的影响　G2Rh2 各组无血清培养MFC细胞活性明显降低,与空白组比较差异有显著性( P < 0101, Fig 1) ,且存在明显的剂量和时间依赖性,而G2Rh2处理各组10% FBS培养后的MFC细胞抑制率与对照组比较差异无显著性( P > 0105) 。

　　Fig 1　Effect of G2Rh2 on cell activ ity ofMFC cells in each group ( .x ±s, n = 6)

　　2. 2　G2Rh2 对M FC细胞形态学的影响　MFC细胞为悬浮细胞,空白组中的MFC细胞边缘整齐,细胞核圆而均匀,核膜之间有光晕,而G2Rh2 (3、10、30mg·L - 1 )给药处理后出现细胞皱缩、胞膜泡状、细胞崩解、核固缩等典型的凋亡特征( Fig 2A、B) 。经Hoechst 33258染色后, 荧光显微镜下观察到对照组胞核呈弥散均匀的荧光,而G2Rh2 各处理组细胞胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光,说明胞核固缩、染色质高度凝聚和碎裂( Fig 2C、D) 。

　　Fig 2　Effect of G2Rh2 on photo m icrographs ofMFC cells( ×200) A: Control group ( undermicroscope) ; B: 10 mg·L - 1 ( undermicroscope) ; C: Control group (Hoechst 33258, under fluorescence microscope) ; D: 10 mg·L - 1 (Hoechst 33258)

　　Fig 3　Effect of G2Rh2 on early apoptotic ra te ofMFC cells A: Control group apop totic rate 119%; B: 3 mg·L - 1 apop totic rate 24%; C: 10 mg·L - 1 apop totic rate 2917%; D: 30 mg·L - 1 apop totic rate 43%

　　2. 3　G2Rh2 对M FC细胞早期凋亡的影响　G2Rh2各组与空白组相比,MFC细胞凋亡率增加,且呈明显的剂量依赖性, 30 mg·L - 1处理组作用1 h时高达43% ( Fig 3 ) , 而各组间坏死率无差异( P >0105) 。

　　2. 4　SP600125对G2Rh2 诱导MFC细胞凋亡的影响　MTT结果显示, G2Rh2 + SP600125各组与相应G2Rh2 处理组相比, MFC 细胞活性均增加( P <0101, Fig 4) , G2Rh2 + SP600125各处理组与空白组比较,差异均有显著性( P < 0101) ,且存在明显的时间依赖性。

　　Fig 4　Effect of G2Rh2 on cell activ ity ofMFCcells after SP600125 trea tmen t( .x ±s, n = 6)

　　A: Control;B: G2Rh2 30 min; C: G2Rh2 30 min + S; D: G2Rh2 1 h; E:G2Rh2 1 h + S; F: G2Rh2 2 h; G: G2Rh2 2 h + S; H: R 4 h; I: G2Rh2 4 h +S;3 3P < 0101 vs C; △△P <0101 vs E; ## P <0101 vs G; ☆P < 0105 vs I2. 5　G2Rh2 对MFC细胞中JNK( c2Jun N2term i2na l k ina se 1 ) 激酶和c2jun 激酶磷酸化的影响　Western blot结果显示,随着G2Rh2 (10 mg·L - 1 )作用时间增加, p2JNK激酶和p2c2jun激酶活性持续增强,作用30 min后两种激酶活性均明显高于对照组( P < 0105) ,而SP600125 (5μmol·L - 1 )处理2 h +G2Rh2 (10 mg·L - 1 )给药处理组两种激酶活性不随时间而改变,与对照组差异无显著性( P > 0105, Fig5) 。

　　Fig 5　Effect of G2Rh2 on the expression of p2JNK and p2c2jun in MFC cells

　　2. 6　G2Rh2 对M FC细胞中ca spa se23活性的影响

　　免疫细胞化学结果显示,未裂解的caspase23细胞胞质和胞核均为蓝色,而裂解的caspase23细胞胞核有紫色阳性区域,胞质无表达;随用药时间的增加,G2Rh2 处理组caspase23的平均光密度值逐渐升高,与对照组比较差异有显著性( P < 0101 ) ; 而SP600125 (5μmol·L - 1 )处理2 h + G2Rh2 (10 mg·L - 1 )给药处理组的caspase23平均光密度值与对照组差异无显著性( P > 0105, Fig 6) 。

　　Fig 6　Effect of G2Rh2 on expression of ca spa se23 ofMFC cells

　　A: Control group; B: 10 mg·L - 1 ; C: SP600125 ( 5 μmol·L - 1 ) +G2Rh2 (10 mg·L - 1 )

　　3　讨论

　　人参皂苷是人参的主要活性成分,在人参皂苷单体中G2Rh2 的抑瘤活性最强,体内外实验结果表明G2Rh2 时间和剂量依赖性地抑制宫颈癌[ 1 ] 、肝癌[ 2 ] 、脑胶质瘤[ 3 ] 、肺癌[ 4 ]等多种肿瘤细胞的增殖,且其诱导凋亡与抑制增殖呈正相关,但目前未见对中国药理学通报　Chinese Pharm acological B ulletin　2008 Jan; 24 (1) ·103·G2Rh2 对胃癌增殖抑制作用的研究报道。本研究结果表明G2Rh2 对无血清培养后的MFC细胞的生长抑制作用亦具有时间和剂量依赖性,而对10% FBS培养后的MFC细胞无明显抑制作用,提示该药的血浆蛋白结合率较高,这与费晓方等[ 5 ]的报道一致。同时本实验通过形态学观察、流式细胞术检测早期凋亡等证明: G2Rh2 亦可时间和剂量依赖性的诱导MFC细胞发生典型凋亡。

　　c2Jun氨基末端激酶( c2Jun N2terminal kinase 1,JNK)信号通路属于丝裂原激活蛋白激酶通路,该通路的激活与细胞凋亡有密切关系[ 6 ] 。JNK是位于胞质、分子质量为54 ku的丝、苏氨酸蛋白激酶,环境中的许多应激因素(如营养因素撤除、物理射线、DNA损伤药物、活性氧等)都能激活JNK。一旦被激活,胞质中的JNK即移位入细胞核,与转录因子ATF2 及c2Jun的氨基末端区域结合,使二者活性区域发生磷酸化,促进基因表达及新蛋白质的合成,新蛋白质作用于细胞凋亡途径的某些环节,从而调控细胞凋亡过程[ 7 ] 。本研究发现, 经G2Rh2 处理的MFC细胞, 30 min后JNK开始被磷酸化,同时c2Jun磷酸化蛋白表达增强,并伴随有细胞凋亡。caspase23是细胞发生凋亡的主要执行蛋白,凋亡过程中p ro2caspase23断裂成17 ku的活化形式,能特异性地切割DNA,致使参与DNA损伤修复的多聚ADP核糖聚合酶( PARP)及DNA依赖性蛋白激酶等失活,促使染色质凝聚和核酸酶激活,导致细胞凋亡[ 8 ] ,本研究中caspase23作为JNK下游效应分子可被一定剂量的G2Rh2 活化并转位入核,并最终介导MFC细胞的凋亡。为进一步证实JNK通路在G2Rh2 诱导MFC细胞发生凋亡过程中的作用,本项研究在G2Rh2 处理MFC 细胞前2 h 加入JNK 抑制剂SP600125,发现其可降低caspase23 表达,部分消弱G2Rh2 对MFC的增值抑制作用,但同时结果也显示SP600125并不能完全抑制G2Rh2 诱导的MFC细胞的凋亡,提示G2Rh2 诱导MFC细胞凋亡的作用机制呈现多环节、多靶点[ 9, 10 ]的特点, G2Rh2 可通过激活JNK通路诱导胃癌细胞凋亡,这可能是其诱导MFC细胞凋亡的机制之一,从而发挥抗肿瘤作用。

　　参考文献:

　　[ 1 ] 　Ham YM, Choi J S, Chun K H, et al. The c2Jun N2terminal kinase 1 activity is differentially regulated by specific mechanisms during apop tosis[ J ]. J B iol Chem , 2003, 278 (50) : 50330 - 7.

　　[ 2 ] 　Oh J I, Chun K H, Joo S H, et al. Caspase232dependent p rotein ki2 nase C delta activity is required for the p rogression of ginsenoside2 Rh2 2induced apop tosis in SK2HEP21 cells [ J ]. Cancer lett, 2005,230 (2) : 228 - 38.

　　[ 3 ] 　Kim H E,Oh J H, Lee S K, et al. Ginsenoside Rh2 induces apop2 totic cell death in rat C6 glioma via a reactive oxygen and caspase dependent butBcl2X(L) 2independent pathway[ J ]. L ife Sci, 1999,65 (3) : 33 - 40.

　　[ 4 ] 　Cheng C C, Yang SM, Huang C Y, et al. Molecularmechanisms of ginsenoside Rh2 2mediated G1 growth arrest and apop tosis in humanlung adenocarcinoma A549 cells [ J ]. Cancer Chem other Pharm a2 col, 2005, 55 (6) : 531 - 40.

　　[ 5 ] 　Fei X F,Wang B X, Tashiro S, et al. Apop totic effects of ginsen2oside Rh2 on human malignant melanoma A3752S2 cells[ J ]. Acta Pharm acol S in, 2002, 23 (4) : 315 - 22.

　　[ 6 ] 　Chen Y, Wu Q, Song S Y, Su W J. Activation of JNK by TPA p romotes apop tosis via PKC pathway in gastric cancer cells [ J ].W orld J Gastroenterol, 2002, 8 (6) : 1014 - 8.

　　[ 7 ] 　Ham Y H,Lim J H,Na H K, et al. Ginsenoside2Rh2 2induced mito2 chondrial depolarization and apop tosis are associated with reactiveoxygen species2and Ca2 + 2mediated c2Jun NH22terminal kinase 1 activation in HeLa cells[ J ]. Pharm acol Exp Ther, 2006, 319 ( 3) :1276 - 85.

　　[ 8 ] 　史艳宇,李　红,杨世杰. 西洋参有效部位对K562细胞凋亡诱导的实验研究[ J ]. 中国药理学通报, 2005, 21 (12) : 1494 - 7.

　　[ 8 ] 　Shi Y Y,Li H, Yang S J. Induction of apop tosis by Panax quinque2folium effective parts ( PQEP) on K562 cells[ J ]. Chin Pharm acol B ull, 2005, 21 (12) : 1494 - 7.

　　[ 9 ] 　王　刚,陈生弟,周海燕,范国华. PACAP27对鱼藤酮诱导细胞凋亡抑制作用机制的研究[ J ]. 中国药理学通报, 2006, 22(1) : 44 - 8.

　　[ 9 ] 　Wang G, Chen SD, Zhou H Y, Fan G H. Themechanism of neuro2p rotective effect of PACAP27 on rotenone2induced apop tosis in PC12 cells[ J ]. Chin Pharm acol B ull, 2006, 22 (1) : 44 - 8.

　　[ 10 ] 邓　蓉, 朱孝峰, 周军民, 高幼衡. 二萜类化合物excisanin A诱导人结肠癌SW620细胞凋亡及机制研究[ J ]. 中国药理学通报, 2006, 22 (3) : 273 - 7.

　　[ 10 ] Deng R, Zhu X F, Zhou J M, Gao Y H. Apop tosis induced by ex2 cisanin A in human colon cancer SW620 cells and itsmechanisms

　　[ J ]. Chin Pharm acol B ull, 2006, 22 (3) : 273 - 7.